口蹄疫的實驗室診斷

董春霞 何 琴

(1.重慶市動物疫病預防控制中心,重慶 401120；2.重慶市巴南區動物疫病預防控制中心,重慶 401320)

口蹄疫的實驗室診斷

董春霞1何 琴2

(1.重慶市動物疫病預防控制中心,重慶 401120；2.重慶市巴南區動物疫病預防控制中心,重慶 401320)

口蹄疫是由口蹄疫病毒所引起的，是一種主要感染包括豬、牛、綿羊、山羊、鹿等在內70多種的偶蹄獸的烈性傳染病，對畜牧業危害巨大，被世界衛生組織列為A類傳染病，在我國也被列為一類傳染病，同時它也是一種人獸共患病。口蹄疫病毒屬于小RNA病毒科，口蹄疫病毒屬，為二十面體對稱的無囊膜的單股正鏈RNA病毒粒子，直徑為26nm，口蹄疫病毒的基因約8500個核苷酸組成。口蹄疫的臨床診斷比較困難，如在山羊和綿羊上，其臨床癥狀不明顯，一些種類的動物感染的口蹄疫病毒毒力較低，另外，一些病毒水泡病，如豬的水泡病、水皰性口炎病毒感染，不能單從臨床上將其與口蹄疫區分開來。因此，確診口蹄疫需要進行實驗室診斷，快速而精確地對口蹄疫進行檢測診斷，對于口蹄疫的防制具有重大的意義，目前，應用于口蹄疫實驗室診斷的方法種類較多，主要包含免疫學診斷和分子生物學診斷兩方面。

1 口蹄疫的實驗室診斷

1.1 病毒的分離

采集患病動物的水泡皮、水泡液、鼻拭子、食道一咽部刮取物、抗凝血或血清、牛奶等樣品。對于死亡動物，可采集其淋巴結、扁桃體、脊髓及心臟等樣品。采集的樣品應冰凍保存，或置于pH值為7.2～7.6的甘油緩沖液中。

病毒的分離可采用細胞培養法和動物接種法。細胞培養法的原理是將分離口蹄疫病毒接種在豬的腎細胞、PK-l5、倉鼠腎細胞等細胞系中，培養一段時間后將病毒從培養細胞中拯救出來，并測定其TCID50。接種動物時，常用的實驗動物是乳鼠，需要接種8～l0只。雖然，通過接種動物可以順利地分離出口蹄疫病毒。但是，其缺點是需要在生物安全三級實驗室中進行試驗，而且試驗環境要求也極為嚴格。

1.2 血清學診斷

1.2.1 補體結合試驗

補體結合試驗是利用已知的抗原（或抗體）、被檢的抗體（或抗原），紅細胞、溶血素兩個系統競爭補體的原理而建立的一種檢測方法。其優點是能對口蹄疫病毒進行分型鑒定，結果判定直觀、可靠。本試驗的缺點是易受樣品質量的影響和樣品中親補體和抗補體物質的干擾，操作程序也較為復雜。

1.2.2 ELISA

ELISA的原理是向吸附有抗原（或抗體）的固相載體中加入待測抗體（或抗原），再加入相應的酶標記抗體（或抗原），生成抗原（或抗體）——待測抗體（或抗原）——酶標記抗體（或抗原）復合物，再與該酶的底物反應生成有色底物，借助分光光度計計算抗體（或抗原）的量。目前，用于口蹄疫診斷的ELISA主要有液相阻斷ELISA、間接ELIA、固相競爭ELISA、夾心ELISA四種。

（1）液相阻斷ELISA

此方法的優點是快速、敏感、準確，在一般實驗室操作即可進行；缺點是檢測結果中有一定的假陽性，需將檢測結果中陰性和可疑的血清樣品再用中和試驗進行進一步的確診。

（2）間接ELISA

間接ELISA是利用2C、3AB、3ABC及3D等口蹄疫病毒非結構蛋白做診斷抗原來區分免疫動物血清抗體和自然感染動物血清抗體。其優點是特異性、準確性高，不足之處是操作過程略顯繁瑣。

（3）固相競爭ELISA

固相競爭ELISA只需將濃縮的、半純化的滅活全病毒146S作為抗原，檢測口蹄疫病毒的抗體。其優點是特異性高、假陽性率低，不足之處是操作繁瑣。

（4）夾心ELISA

夾心ELISA方法優點是快速、敏感、準確，在檢測田間樣品時，敏感性高于補體結合試驗。其缺點是實驗條件要求高，檢測過程需要在特殊的實驗室進行。

1.2.3 病毒中和試驗

其原理是利用血清中和抗體與口蹄疫病毒發生特異性結合，從而使口蹄疫病毒喪失對易感動物和敏感細胞的感染力。中和試驗的優點是既可以鑒定抗原，又可以對血清抗體進行定量測定，缺點是需要培養單層細胞或飼養實驗動物。

1.2.4 間接血凝試驗

（1）正向間接血凝試驗

其原理是將滅活的各型病毒致敏由綿羊紅細胞制備的診斷試劑，當其與之相應的血清型的血清反應時即可發生紅細胞凝集現象。其優點是試驗設備簡單、操作簡便、靈敏度高，能大規模的檢測血清中的抗體。缺點是不同批號的產品效價有波動。

（2）反向間接血凝試驗

其原理是將口蹄疫病毒的抗體以化學方法偶聯于醛化的綿羊紅細胞上，當貼附于血球的抗體與游離的抗原相遇并形成抗原-抗體凝集網絡時，綿羊紅細胞也隨之凝集，出現了肉眼可見的血球凝集現象。其優點是簡單、快捷，適合于基層使用，是我國口蹄疫病毒鑒定的行業標準。缺點是檢測結果的人為主觀性強。

1.2.5 非結構蛋白抗體試驗

病毒的非結構蛋白不形成其衣殼蛋白。進行非結構抗體試驗時，鑒別診斷的依據是：目前使用的口蹄疫疫苗主要為滅活疫苗或亞單位疫苗，在動物體內不會出現病毒增殖，因此，病毒特異性非結構蛋白（NSP）不能表達產生NSP抗體。而自然感染動物后，則有病毒增殖，有NSP抗體產生。因此，可以利用是否檢測到NSP抗體來區分自然感染動物與疫苗免疫動物。目前，我國已經建立了檢測3ABC抗體的ELISA方法，并廣泛應用干臨床檢測。

此方法的優點：（1）試劑和樣品用量極小，可以低至1～2μl；（2）無需熒光顯微鏡和酶標檢測儀等儀器，非常適合現場使用；（3）沒有有害物質（如放射性同位素、鄰苯二胺等）的參與；（4）檢測時間較短，1～5 min就可以得到結果，并可長期保存；（5）膠體金的敏感性可達到ELISA水平，若結合銀染色則檢測的敏感性可大大提高。其缺點是免疫層析快速診斷試紙條對疾病的檢測屬于定性檢測，結果只有陰性和陽性，判定結果往往帶有主觀性。2008年，蔣韜等人通過將純化的口蹄疫流行株O/ China99、A/AF72、AsiaⅠ/China05 抗體和羊抗豚鼠抗體分別包被在硝酸纖維素膜上，作為檢測帶與質控帶，組裝形成膠體金定型診斷試紙條，能夠對口蹄疫病毒進行快速、靈敏、特異的診斷。2009，林彤等人采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標記純化的抗Asia1 型口蹄疫病毒的單克隆抗體，將該標記物與羊抗豚鼠IgG 分別包被在硝酸纖維素膜上，作為檢測帶和質控帶，組裝成檢測Asia1 型口蹄疫的診斷試紙條，也能快速、靈敏、特異的診斷口蹄疫病毒。

1.3 分子生物學診斷

1.3.1 RT-PCR

RT-PCR的原理是將單鏈RNA病毒的核酸序列反轉錄成雙鏈，然后再擴增雙鏈核酸和進行電泳試驗，最后通過觀察目的條帶的大小來進行診斷。該方法利用TaqMan技術，選擇3D基因區設計了一組特異的引物和探針，可快速檢測O、A、C及Asia I型口蹄疫病毒，且可對病毒進行定量檢測，具有高度的特異性和實時性。其優點是耗時較短、敏感性高、特異性強，利于快速、準確地診斷出口蹄疫。缺點是需要提取口蹄疫病毒的RNA，需要在特定的實驗室進行檢測，不利于現場對口蹄疫進行診斷。2007年，Andrew E. Shaw等人設計出了一步診斷口蹄疫的RT-PCR的方法，相較于兩步法，其檢測的敏感性有所提高，但當口蹄疫病毒滴度太低時，也不能準確的檢測。

1.3.2 熒光定量PCR

所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

實時熒光定量PCR的關鍵是使用了熒光探針及其相應的熒光信號檢測裝置，其檢測方法可分為兩類：一類是非特異性的雙鏈DNA嵌入染料，如SYBR Green I；另一類是以雜交形式進行的單鏈檢測系統，有水解探針（如Taq-Man）、雜交探針、分子信標、熒光標記引物等。熒光定量PCR的優點：（1）解決了傳統PCR方法耗時長、單次檢測的樣品受限、判定的結果具有主觀性等不足；（2）由于實時熒光定量PCR技術有定量檢測功能，擴大了傳統PCR方法的應用領域。缺點：（1）由于減少了擴增后電泳的檢測步驟，因此，不能檢測擴增產物的大小；（2）因為熒光素種類以及檢測光源的局限性，從而相對地限制了其復合式檢測的應用能力；（3）熒光定量PCR實驗成本比較高。

1.3.3 環介導等溫擴增技術（LAMP）

LAMP的原理與RT-PCR相似之處是，都需要通過擴增目的基因片段，然后對擴增產物進行瓊脂糖電泳實驗，最后觀察產物條帶的方法來進行診斷。與RT-PCR相比，LAMP技術具有以下優點：（1）敏感性高。它能從極低微量的拷貝中擴增出目的基因片段，這比傳統PCR高出10～1000倍，同時還具有與RT- PCR同樣的敏感性。有研究發現，加環引物的敏感性要比沒有加環引物的高出7個數量級，即使模板量為0.01 PFu時，也可獲得檢測結果。（2）特異性好。通過對人流感病毒和人皰疹病毒等病毒的研究結果表明，LAMP不僅能對多血清型的同一病原體進行定型，而且不會出現假陽性結果。（3）簡便。由于LAMP是在等溫的條件下進行的，所以在進行實驗室診斷時，只需要水浴鍋或其他等溫設備即可，而不需要PCR等實驗的昂貴儀器。（4）快速。通常只需要30～60min即可得到檢測結果。（5）易于判定試驗結果。判定結果時，不需要進行電泳，只需要肉眼觀察擴增管的濁度或通過向擴增產物中加入熒光染料觀察其顏色變化即可。（6）可與反轉錄結合，對RNA分子進行擴。

1.3.4 核酸雜交技術

核酸雜交技術是通過將同位素標記的FMDV基因組序列作為探針，然后與口蹄疫基因組RNA特定區域進行反應而建立的檢測方法。1998年，Rossi等用P32標記克隆在質粒上的口蹄疫病毒基因組聚合酶序列作為探針，檢測感染口蹄疫病毒牛的食道一咽部刮取物即可。其優點是快速、準確。不足之處是要求用活毒進行檢測，對實驗室要求較高。

2 討論

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是目前檢測FMDV感染較為常用的診斷方法，其與間接血凝抑制試驗、免疫擴散沉淀試驗等檢測方法相比，具有靈敏、快速、價廉等優點。口蹄疫檢測技術在臨床上廣泛使用的主要是無生物安全要求的血清學診斷技術，如液相阻斷ELISA、非結構蛋白抗體間接ELSIA等。前者主要用于動物疫苗免疫抗體監測，評價疫苗免疫動物抗體水平；后者主要用于FMD感染和人工免疫的鑒別診斷，區分免疫動物和自然感染動物是防治FMD的一項重要工作，通過血清學檢測能了解畜群的FMD的免疫抗體合格情況和感染狀況。RT-PCR主要是用于口蹄疫疫情爆發時采集組織樣品的病原學診斷，并可以區分0型、A型和亞洲I型，對口蹄疫的防控提供重要的技術支撐。