淺談鴨瘟病毒的分離與鑒定方法

劉 昆 （山東省昌樂縣畜牧獸醫(yī)局 262400）

鴨瘟(Duck Plague，DP)，是由鴨瘟病毒(Duck plague virus，DPV)引起的鴨、鵝和天鵝等水禽的一種急性接觸性傳染病，其特征是流行廣泛、傳播迅速、發(fā)病率和死亡率高，嚴(yán)重威脅養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。

1 鴨瘟病毒分離

DPV主要侵害免疫器官，病毒的分離一般采用發(fā)病急性期或者死亡后的病鴨血液、肝、脾或者腎臟等組織處理后接種細(xì)胞培養(yǎng)物、雛鴨及鴨胚進(jìn)行病毒的分離鑒定，后結(jié)合電鏡觀察及血清學(xué)診斷加以確診。

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

病毒接種鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)后，產(chǎn)毒量高，蝕斑明顯，病毒分離效果好；成纖維樣傳代細(xì)胞系CCL-41產(chǎn)毒量較DEF低，但病變穩(wěn)定、蝕斑易觀察，同時(shí)傳代細(xì)胞系健康史可知，更易獲取。

1.2 鴨胚分離

通過接種9～14日齡鴨胚絨毛尿囊膜分離病毒，4～10d后鴨胚死亡并出現(xiàn)特征性的彌散性出血，致死的胚體出血、水腫，肝出血、壞死，部分絨毛尿囊膜上有灰白色壞死灶。若初代分離為陰性時(shí)，收獲鴨胚絨毛尿囊膜均質(zhì)化處理后盲傳2～4代可產(chǎn)生病變。

1.3 雛鴨接種

肌肉注射1日齡易感雛鴨(番鴨較北京鴨更易感)，3～12d后感染鴨發(fā)病死亡，尸檢典型病變，確診可結(jié)合攻毒保護(hù)試驗(yàn)或免疫熒光技術(shù)。低毒力或非致病毒株可能不引起臨床癥狀，此時(shí)應(yīng)檢測存活鴨體內(nèi)抗體水平。

2 鴨瘟診斷方法

2.1 血清學(xué)診斷

2.1.1 血清中和試驗(yàn)(SN) 血清學(xué)試驗(yàn)主要采用固定血清/稀釋病毒法，根據(jù)中和指數(shù)M做出判定：0

2.1.2 微量固相放射免疫試驗(yàn)(Micro-SPRIA) Micro-SPRIA是以表面能吸附抗體的塑料或其它材料作固相載體，用同位素標(biāo)記抗體或抗原微量，測定相應(yīng)抗原或抗體的一種微量檢測技術(shù)。該方法可用于直接檢測肝、脾、腦及血清等病料，于人工發(fā)病后46h就能以80%的檢出率檢出雛鴨肝臟中的病毒，成年鴨于48h后可檢出，其檢出率為100%。此法特異性強(qiáng)、敏感、快速、經(jīng)濟(jì)，但實(shí)驗(yàn)條件要求較高。

2.1.3 瓊脂糖凝膠沉淀試驗(yàn)(AGP) AGP是在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行的抗原抗體免疫沉淀反應(yīng)。特點(diǎn)是簡單、特異、試驗(yàn)條件要求低，既可定性又可定量，易于推廣，但敏感性不好。

2.1.4 反向間接血凝試驗(yàn)(RPHA) RPHA法利用抗體致敏紅細(xì)胞在相應(yīng)抗原存在時(shí)會(huì)凝集而進(jìn)行檢側(cè)。該法3h可判讀結(jié)果，操作簡便，不需昂貴的設(shè)備試劑，致敏細(xì)胞可長期保存，但敏感性較明膠顆粒凝集試驗(yàn)及間接免疫熒光試驗(yàn)分別低25倍和65倍，不適合小量DPV檢測。對以診斷為目的急性DPV感染來說，感染患鴨大量排毒而使送檢組織存在大量病毒，RPHA足夠敏感，具有實(shí)用價(jià)值。

2.1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) ELISA是DPV診斷上使用最廣泛的一種方法，簡單快速、經(jīng)濟(jì)準(zhǔn)確。既可測抗體又可檢抗原，樣品需要量少，結(jié)果容易判斷，易于基層推廣，是一種適合于對鴨群進(jìn)行免疫抗體水平檢測，簡便實(shí)用的方法

2.1.6 免疫熒光技術(shù) 免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)快速準(zhǔn)確，敏感性稍低于雛鴨接種，但費(fèi)用設(shè)備要求較高，且非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序比較復(fù)雜。

2.2 分子生物學(xué)診斷

DPV的分子生物學(xué)研究一直相對滯后于其它皰疹病毒，上世紀(jì)80年代中期以來分子生物學(xué)技術(shù)被逐漸應(yīng)用于DPV診斷并取得了極大進(jìn)展。

2.2.1 核酸探針技術(shù) 核酸探針技術(shù)是最早用于DPV診斷的分子生物學(xué)方法，使用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記核酸作為探針，在待檢組織細(xì)胞識(shí)別特定核酸序列并顯示陽性雜交信號(hào)。地高辛標(biāo)記探針技術(shù)是以非放射性的地高辛標(biāo)記核酸片段，利用堿基互補(bǔ)原理檢測目的核酸片段的一種方法。該方法不需要特殊儀器，結(jié)果易于判定，重復(fù)性好，是目前廣泛應(yīng)用的分子生物學(xué)檢測技術(shù)

2.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)具有靈敏性高、特異性強(qiáng)、操作簡便、檢測時(shí)間短等特點(diǎn)。快速準(zhǔn)確地檢測處于潛伏期的DPV，同時(shí)PCR檢測體系以感染組織的DNA為模板，不需提純病毒，檢測結(jié)果受樣品質(zhì)量的影響較小，為迅速地檢測病毒，及時(shí)采取 防治措施贏得了寶貴時(shí)間。

2.2.3 原位雜交技術(shù) 原位雜交(in situ hybridization ISH)技術(shù)是分子生物學(xué)和組織化學(xué)成功結(jié)合的產(chǎn)物，能對組織細(xì)胞內(nèi)特定的DNA或RNA序列進(jìn)行定位研究。該方法具有直觀、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，是對DPV進(jìn)行檢測和病原定位的良好方法，可用于DPV的侵染過程和致病機(jī)理研究及回顧性診斷檢測。同時(shí)，還可觀察病原定位的細(xì)胞類型以及組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征與病理變化。

鴨瘟病毒廣泛存在于各種水禽，各年齡段的鴨均可發(fā)病。近幾年，鴨瘟在我國很多地區(qū)流行，給我國的養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。了解病毒的分離與鑒定方法，有利于建立有效的診斷方法，對鴨瘟的防控有重大意義。