獸醫(yī)實驗室ELISA檢測中應(yīng)注意的問題

曲百友 王劍

獸醫(yī)實驗室ELISA檢測中應(yīng)注意的問題

曲百友 王劍

（山東省鄒平縣畜牧獸醫(yī)局 256200）

由于酶聯(lián)免疫吸附測定ELISA具有樣品前處理簡便快速準(zhǔn)確所需儀器廉價等優(yōu)點已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)檢驗的各領(lǐng)域中，也是獸醫(yī)免疫學(xué)檢驗中最為常用的方法，基層獸醫(yī)實驗室免疫學(xué)檢驗的主要檢測內(nèi)容包含豬瘟抗體、藍(lán)耳病抗體、口蹄疫(O型，A型，亞洲I型)抗體。其中口蹄疫三種亞型液相阻斷ELISA抗體檢測的量最大，檢測程序最復(fù)雜。筆者在工作中體會到ELISA法檢測的質(zhì)量控制很重要，正確的操作方法是保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確的必要條件。現(xiàn)將操作中常出現(xiàn)的問題報告如下：

1 動物采血和樣本處理

一般在醫(yī)學(xué)免疫檢驗中均以血清作為檢測標(biāo)本。牛羊一般采用頸靜脈采血，豬一般采用耳靜脈采血。采集中應(yīng)注意動作輕柔，避免溶血，因紅細(xì)胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)影響，檢測結(jié)果。標(biāo)本儲存時間過長，IgG可能會聚合成多聚體，在間接ELISA測定中導(dǎo)致本底過深，甚至造成假陽性。一般在5d內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃箱中，超過1周測定的需低溫冰存。

2 回溫

常用的試劑盒說明書中都提到低溫儲存使用前恢復(fù)到室溫但對室溫并沒有明確規(guī)定。經(jīng)驗證明日常的20~ 25℃的室溫并不十分適合，因為較高的溫度對于操作者尤其是生手會使孔與孔之間產(chǎn)生很大的差別，影響結(jié)果。因此采用盡量低的溫度。具體溫度以洗滌液中的結(jié)晶通過充分的振搖能夠完全溶解為準(zhǔn)。

3 加樣

在ELISA中操作最多的是加樣，涉及每一步驟。目前加樣一般都使用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。加樣時首先注意應(yīng)將所加物加在板孔底部，避免加在孔壁上部，不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。在加入不同物質(zhì)時應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染。另外，在顯色時，最好使用多道微量加樣器，使加液過程迅速完成，因為顯色對時間的要求較高，最好是同一時間顯色，加樣時間越統(tǒng)一，結(jié)果誤差越小。特別是在口蹄疫液相阻斷ELISA試劑盒使用中。加樣及倍比稀釋的時間越長結(jié)果偏差越大。

4 孵育

抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會，只有最貼近孔壁的一層溶液中抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。ELISA法一般采用37℃恒溫，可將ELISA板置于恒溫箱中。為避免蒸發(fā)，一定要用封板條封住反應(yīng)孔。反應(yīng)板均不疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。

5 洗滌

洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技，應(yīng)引起操作者的高度重視。

5.1 血液凝固不全引起的假陽性 血液凝固不全時有纖維吸附現(xiàn)象，致使洗板不凈，殘留的非固相酶產(chǎn)生的非特異性顯色影響結(jié)果，而且這種顯色很深易誤認(rèn)為強(qiáng)陽性。

5.2 洗液 洗液要臨用前新鮮配制，放置時間過長易產(chǎn)生絮狀物或混濁，造成賭孔或花板。使用洗板機(jī)時候要注意設(shè)置好洗板液量和間隔時間。

5.3 拍板 有些ELISA過程中需要拍掉殘余的水分，應(yīng)在吸水紙上輕輕拍打，次數(shù)不宜過多。如果手重容易拍掉包被的抗原或抗體。造成結(jié)果不準(zhǔn)。

6 比色與結(jié)果判定應(yīng)注意的問題

顯色后一定要在規(guī)定時間內(nèi)用酶標(biāo)儀進(jìn)行讀取。

7 保護(hù)

ELISA法檢測在傳染性疾病的診斷中應(yīng)用很廣泛，特別是基層實驗室，同時OPD及TMB也均有致癌性。所以加強(qiáng)ELISA法的全程質(zhì)量控制和重視操作中的一些安全問題對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢測人員安全性非常重要。應(yīng)針對每項操作建立完善的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，加強(qiáng)對檢驗人員的統(tǒng)一管理，嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行操作，確保檢測人員安全性。

（2014–04–14）

S851.2+1

C

1007-1733(2014)05-0066-01