禽流感診斷檢測方法綜述

王涌

禽流感診斷檢測方法綜述

王涌

（山東省昌樂縣畜牧獸醫(yī)局 262400）

禽流感(Al)又名真性雞瘟、歐洲雞瘟，是由A型流感病毒引起的一種禽類(家禽和野禽)感染和疾病綜合征。1878年首次發(fā)現(xiàn)于意大利，是人類最早發(fā)現(xiàn)的病毒，疾病之一。1955年Schafer首次證明其病原是A型流感病毒現(xiàn)在該病已遍布于世界上許多國家和地區(qū)，對世界養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，甚至對人類的衛(wèi)生健康都形成了一定的威脅，被國際獸疫局定為A類傳染病。根據(jù)AIV對禽類致病性的差異，可將AIV分為高致病性禽流感病毒(HPAIV)和低致病性禽流感病毒(LPAIV)。高致病性禽流感以突然死亡和高死亡率為特征，常可導(dǎo)致感染雞群的全軍覆沒，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。而低致病性禽流感主要引起呼吸道癥狀，產(chǎn)蛋率、受精率及孵化率下降為主要特征。A型流感病毒每個核甘酸在每個復(fù)制周期中的突變機(jī)率大約是1.5×10-5，與其它RNA病毒的突變率相似。但是，由于流感病毒的基因組分為8個不同的片段，在病毒增殖過程中很容易發(fā)生基因重排，因而使流感病毒的抗原性和致病性很容易發(fā)生變異。因而檢測流感病毒，有主與更好的了解流感的流行現(xiàn)狀，并實施相應(yīng)的疫苗接種來有效的防控。

1 血清學(xué)診斷技術(shù)

1.1 血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI) AIV囊膜表面的血凝素能凝集多種動物的紅細(xì)胞，這種凝集特性能被特異的血清抑制。血凝(HA)試驗主要用于AIV的常規(guī)檢測，血凝抑制(HI)試驗可用于AIV的鑒定和血清中AIV抗體濃度的測定。HI試驗具有較高的特異性和敏感性，但在做(HI)試驗時，需要先去除血清中的非特異性的凝集因素，同時需要對抗原進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，目前WHO一般采用此方法進(jìn)行全球流感病毒的監(jiān)測。

1.2 瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(AGP) AGP試驗一般用來檢AIV的共同抗原核蛋白或基質(zhì)蛋白。由于所有A型流感病毒的核蛋白以及基質(zhì)蛋白都具有相似的抗原性，所以針對AIV的AGP試驗都是檢測這兩類抗原的抗體。瓊脂擴(kuò)散試驗操作簡單，即可以定性又可以定量。1970年，Beard首次建立了用于禽流感抗原檢測的AGP方法。AGP最常用的方法是免疫雙擴(kuò)散(IDD)。AGP檢測抗核蛋白的抗體，既可以定量又可以定性，該方法操作簡單，重復(fù)性好，敏感性強(qiáng)。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) ELISA具有較高的敏感性，既可以檢測抗體，又可以檢測抗原。尤其適合于大批樣品的血清學(xué)調(diào)查，可以標(biāo)準(zhǔn)化而且結(jié)果易于分析。在H9禽流感的控制撲滅、檢疫中廣泛使用。1974年，Jennings等首先用ELISA方法對流感病毒免疫后抗體產(chǎn)生規(guī)律進(jìn)行監(jiān)測。之后，ELISA診斷方法的研究在國外發(fā)展很快。國內(nèi)外大多采用間接ELISA和競爭ELISA檢測雞群抗體水平。李海燕等利用混和纖維素酯微孔濾膜建立了斑點ELISA，該方法不僅敏感性和特異性好，而且結(jié)果易于判定，非常適合現(xiàn)場H9N2亞型AIV抗體的檢測及流行病學(xué)調(diào)查。此后又利用重組NP蛋白建立了間接ELISA，和免疫金標(biāo)快速檢測試紙條等。其他還有補(bǔ)體結(jié)合、神經(jīng)氨酸酶活性抑制和單輻射溶血試驗等。

2 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

2.1 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 近幾年來，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)已被大量應(yīng)用于禽流感的快速診斷。RT-PCR 是目前發(fā)展最成熟的分子診斷技術(shù)，是一種體外基因擴(kuò)增技術(shù)，能在數(shù)小時內(nèi)使DNA呈指數(shù)倍增加。可以從基因水平檢測AIV的RNA，可以大大縮短對禽流感病原的檢出時間，為禽流感的早期快速診斷提供了更敏感、更快速的方法。該技術(shù)具有高度的敏感性和特異性，可大大縮短對AIV的檢出時間，不僅克服了病毒分離鑒定試驗周期長的缺點，而且克服了因野外取材混有其他病毒造成的誤診，為AIV早期快速診斷提供了敏感、快速、實用的檢測方法。目前已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。利用RT-PCR方法鑒定H9N2亞型禽流感的是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的方法之一。

2.2 RT-PCR-ELISA法 Chaharaein等研究了用于快速檢測H9N2亞型AIV的RT-PCR-ELISA法，與標(biāo)準(zhǔn)的病毒分離法以及血清學(xué)試驗(血凝試驗和血凝抑制試驗)進(jìn)行比較，基于H9亞型AIV的RT-PCR-ELISA 法對SPF雞體內(nèi)H9N2亞型AIV檢測敏感性與病毒分離法相比達(dá)到100%，RT-PCR-ELISA的敏感性是凝膠電泳法的10倍，說明RT-PCR-ELISA 法對于檢測A型流感病毒，特別是雞體內(nèi)H9N2亞型AIV 亞型是一個非常簡便、敏感的方法。

2.3 膠體金免疫層析技術(shù) 20世紀(jì)80~90年代在酶聯(lián)免疫吸附試驗、乳膠凝集試驗、單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展了新型體外診斷技術(shù)--膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)。GICA對樣品要求不高，組織液、血清、糞便和尿液等均可十min即可出現(xiàn)結(jié)果，肉眼即可判斷；準(zhǔn)確可靠，特異性強(qiáng)，靈敏度高，可達(dá)到ELISA 水平；應(yīng)用廣泛，成本低，保存方便，更有利于臨床現(xiàn)場檢測使用。

2.4 熒光RT-PCR 熒光RT-PCR技術(shù)是20世紀(jì)90年代末才發(fā)展起來的新技術(shù)，是將熒光素標(biāo)記的探針與引物一起在熒光PCR儀中反應(yīng)，電腦對整個反應(yīng)進(jìn)行實時監(jiān)測，避免了交叉污染，與常規(guī)RT-PCR方法相比，其靈敏度和特異性都有所提高，對PCR產(chǎn)物無需進(jìn)行后處理，縮短了檢測時間。商品化試劑盒的問世，使該技術(shù)操作起來十分簡單、方便。

隨著時間的推移會有更簡便、更高效、更準(zhǔn)確的方法出現(xiàn)，但是對于疑似高致病性禽流感發(fā)病禽群要及時按照國家要求進(jìn)行上報，在確診后進(jìn)行隔離禽場或禽舍，嚴(yán)禁將病禽或可疑病禽上市，病死禽必須深埋或焚燒。只有這樣才能真正的控制流感的發(fā)生。

[1] 王重慶. 分子免疫學(xué)基礎(chǔ)[M]. 北京: 北京大學(xué)出版社,1997, 223-225.

[2] 孫明, 李純鈴, 趙鐵柱等. 禽流感病毒A型和H5亞型RT-PCR檢測試劑盒研究[J]. 中國實驗動物學(xué)報.

（2014–02–23）

S858.31

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1007-1733(2014)05-0087-02