犬瘟熱病毒病原學(xué)和診斷技術(shù)研究進(jìn)展

孫禮 王妍慧

文獻(xiàn)綜述

犬瘟熱病毒病原學(xué)和診斷技術(shù)研究進(jìn)展

孫禮 王妍慧

（山東省萊陽市畜牧獸醫(yī)局 265200） （山東省萊陽市畜牧獸醫(yī)站）

犬瘟熱病毒(Canine distemper virus, CDV)是引起犬科、鼬科及一部分浣熊科或其它食肉目動物犬瘟熱(Canine distemper, CD)的病原[1]。幼齡未免疫動物感染CDV后多表現(xiàn)為急性致死性經(jīng)過，臨床上以雙相熱型、結(jié)膜炎、嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)炎癥，以及后期出現(xiàn)神經(jīng)癥狀為主要特征，成年動物可耐過或呈慢性持續(xù)性感染。目前CDV在世界范圍內(nèi)呈廣泛性流行，感染宿主的范圍不斷擴(kuò)大，多種動物都能感染和傳播該病原[2]。

1 病原學(xué)研究進(jìn)展

1.1 病原分類及結(jié)構(gòu) CDV屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)，副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)，麻疹病毒屬(Morbillivirus)，與麻疹病毒(Measles virus，MV)、牛瘟病毒 (Rinderpest virus，RPV)、小反芻動物瘟疫病毒(Pestedes petits ruminants pestivirus，PPRV)、海豹瘟熱病毒(Phocine distemper virus，PDV)、海豚瘟熱病毒 (Porpoise morbillivirus，PMV)同屬[3]。在病毒結(jié)構(gòu)和超微形態(tài)上，CDV與MV和RPV是幾乎完全相同的，三者親緣關(guān)系最近，具有相似的分子生物學(xué)特征和抗原關(guān)系[4]。CDV病毒粒子形狀多樣，多呈球形或多形性，有時呈長絲狀，直徑為120~350 nm。病毒粒子中心含有主要由基因組RNA和核衣殼蛋白亞單位組成的螺旋狀核衣殼，寬徑約15~17 nm。目前，CDV只有一個公認(rèn)的血清型，未見有新血清型被發(fā)現(xiàn)的報(bào)道，但是在感染犬病例中發(fā)現(xiàn)一些基因型的CDV強(qiáng)毒株具有不同毒力和細(xì)胞嗜性，說明CDV可能存在不同的血清型[5]。

1.2 基因組結(jié)構(gòu) CDV為不分節(jié)、非重疊的單股負(fù)鏈RNA病毒。病毒基因組全長為15690 bp，從3’端到5’端依次為3’前導(dǎo)序列(3’Leader sequence)，核衣殼(Nucleocapsid，N)基因、磷蛋白(Phosphoprotein，P)基因、基質(zhì)膜蛋白(Membraneprotein，M)基因、融合蛋白(Fusionprotein，F(xiàn))基因、血凝素蛋白(Hemagglutinin，H)基因和大蛋白(Largeprotein，L)基因六個蛋白編碼序列，以及5’尾隨序列(5’Trailer sequence)，磷蛋白基因(P)內(nèi)部還有C和V兩個非結(jié)構(gòu)蛋白基因。其中3’端前導(dǎo)序列與5’端尾隨序列指導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程；N蛋白、P蛋白和L蛋白組成的螺旋形衣殼包裹負(fù)鏈RNA，形成核糖核蛋白復(fù)合體，這種復(fù)合體是病毒基本的感染單位，是病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的[6]；H蛋白和F蛋白在病毒囊膜上形成與病毒的入侵和細(xì)胞毒性直接相關(guān)的纖突，具有吸附功能，能讓病毒結(jié)合到細(xì)胞表面的受體上[7]。

1.3 主要蛋白及其基因 （1）血凝素蛋白(H)及其基因。H蛋白基因全長1947 bp，所有毒株起始密碼子ATG均位于21~23位核苷酸處，但由于終止密碼子在不同毒株存在差異，從而引起不同毒株H基因編碼的氨基酸殘基數(shù)不同[8]。野毒株和Convac株H基因編碼607個氨基酸殘基，而Onderstepoort疫苗株只編碼604個氨基酸殘基。目前CDV主要分為疫苗型(Vaccine)和Asia1、Asia2、USA(Ameri ca)、Europe、Arctic6個基因型[9]。Lednicky等[10](2004)對2000~2001年美國浣熊中流行的CDV野毒株研究發(fā)現(xiàn)，其H、F和P基因序列與CDV疫苗株在遺傳距離上較遠(yuǎn)，在遺傳系統(tǒng)發(fā)育樹上處于USA(America)型的不同兩個基因簇，建議將USA(America)型分為America 1和America 2基因型。趙建軍等[11](2011)通過對中國狐、貉和水貂養(yǎng)殖場中CDV毒株進(jìn)行血凝素基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，在發(fā)育進(jìn)化樹上發(fā)現(xiàn)了有別于常見的6個基因型的HLJ1和HLJ2兩個毒株，將其劃分為Asia 3型。但是不同基因型的CDV在病原致病力和免疫原性等方面存在怎樣的差異，目前還沒有明確的研究結(jié)論。因此對H基因進(jìn)行克隆測序分析，對于探討犬瘟熱免疫失敗的原因和進(jìn)行犬瘟熱的流行病學(xué)監(jiān)測具有重要的意義。H蛋白是CDV囊膜表面的一種構(gòu)成囊膜纖突主要成份的Ⅱ型糖蛋白，相對分子質(zhì)量為76 KD。H蛋白在病毒感染過程幫助病毒識別并吸附到細(xì)胞表面受體上，使囊膜與宿主細(xì)胞膜發(fā)生融合，與F蛋白一起協(xié)助CDV進(jìn)入宿主細(xì)胞。von Messing等[12](2005)還發(fā)現(xiàn)位于H蛋白結(jié)構(gòu)上臨近的2個功能區(qū)的6個必需氨基酸殘基起到識別宿主細(xì)胞受體并啟動膜融合的作用。H蛋白作為CDV主要結(jié)構(gòu)蛋白，可產(chǎn)生中和抗體，是細(xì)胞毒性T細(xì)胞作用的抗原決定部位，是宿主免疫系統(tǒng)識別的最主要的靶抗原。有研究表明，近年來犬瘟熱暴發(fā)的一個重要原因可能是H蛋白上潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)的遺傳變異，這些位點(diǎn)的差異可能直接影響了病毒的抗原性。因此目前大部分針對CDV抗原性變異的研究集中在H蛋白上。Panzera Y等[13](2011)報(bào)道所有南美CDV毒株與疫苗株氨基酸存在高差異，這種遺傳變異可能是導(dǎo)致犬瘟熱在接種疫苗的犬種群中死灰復(fù)燃的因素。Müller A等[14](2011)報(bào)道，在葡萄牙自由放養(yǎng)的狼中發(fā)現(xiàn)的CDV有家犬起源的血凝素基因特性，這表明這些狼的犬瘟熱病毒來自本地狗，而不是從野生動物物種中傳播的。Nikolin VM等[15](2012)結(jié)合全球范圍內(nèi)公布的138株CDV基因序列數(shù)據(jù)，調(diào)查犬瘟熱病毒HA蛋白的SLAM結(jié)合區(qū)域530 (G/E到R/D/N)和549 (Y到H)位點(diǎn)的氨基酸替換對犬瘟熱病毒由家犬適應(yīng)株蔓延到其他食肉動物的重要性。但沒有發(fā)現(xiàn)氨基酸530位點(diǎn)受到宿主物種的強(qiáng)烈影響的證據(jù)。（2）融合蛋白(F)及其基因。F基因全長2205bp，含有4個起始密碼子，前三個是在所有毒株中均是完全保守的位于86~88、266~268、408~410核苷酸處的AUG，第四個起始密碼子是461~463核苷酸處的AUA或AUG[16]。Cherpillod等[17](2004)應(yīng)用基因突變技術(shù)，來研究CDV A75/17毒株和 Onderstepoort 疫苗株中F蛋白表達(dá)量與翻譯起始密碼子之間的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)86-88位的AUG是F蛋白主要的翻譯起始密碼子，其使用頻率是266-268位AUG的3倍，此外位于閱讀框架內(nèi)的兩個甲硫氨酸(l和61位氨基酸)殘基中的任何一個都是F蛋白有效表達(dá)所必需的。

F蛋白是CDV囊膜上的I型糖蛋白，分子量為62KD，由通過二硫鍵連接成異種蛋白二聚體的F1(45ku)和F2(23 ku)兩個亞單位組成，其中F1蛋白位于囊膜的外側(cè)，并且形成一個胰蛋白酶的特異酶切位點(diǎn)。F蛋白在CDV囊膜上呈纖突狀，主要是協(xié)助CDV通過囊膜與細(xì)胞膜發(fā)生融合后穿過細(xì)胞膜侵染細(xì)胞。在麻疹病毒成員中，F(xiàn)蛋白的主要群特異性表位是麻疹病毒屬異型免疫的主要交叉抗原。F蛋白上存在犬抗原提呈細(xì)胞最優(yōu)先識別的輔助性T淋巴細(xì)胞表位，可誘導(dǎo)動物機(jī)體引起免疫反應(yīng)，能阻止病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制復(fù)制，從而抑制病毒感染，可用于研制基因工程亞單位疫苗[18]。（3）核蛋白(N)及其基因。N基因全長1683 bp，ORF起始于53~55位的AUG，終止于1677-1679位的UAA，編碼523個氨基酸，蛋白分子量為58 KD。N蛋白是核衣殼的主要組成成分，與CDV的毒力密切相關(guān)，有包裹及保護(hù)內(nèi)部基因的功能，而且N蛋白的中間保守區(qū)含有核衣殼包裝和病毒 RNA核衣殼化所必需的信息。N蛋白1~8位氨基酸殘基在CDV轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核過程中起了特別關(guān)鍵作用，因此N蛋白在CDV的結(jié)構(gòu)和功能上起著極其重要作用。N蛋白是麻疹病毒屬中較為保守的免疫原性蛋白，1~80位和337~358位氨基酸殘基是N蛋白誘發(fā)抗體的主要抗原表位，可刺激動物機(jī)體產(chǎn)生早期中和CDV的抗體。此外，N蛋白上含有T細(xì)胞表位，在細(xì)胞免疫方面發(fā)揮著重要作用[19]。

2 診斷技術(shù)研究進(jìn)展

2.1 病毒分離培養(yǎng)及鑒定 CDV分離培養(yǎng)是確診該病最確切的診斷方法，幾個來自不同物種和組織的細(xì)胞株和原代細(xì)胞已用于CDV的分離和感染，其中原代細(xì)胞主要有犬或貂的肺和腹腔巨噬細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞、腎細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞等；傳代細(xì)胞主要包括非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)，狨猴淋巴樣細(xì)胞(B95a)，Madin Darby狗腎細(xì)胞(MDCK)，犬巨噬細(xì)胞(DH82)。但最有效的方法是用幼犬或雪貂的肺臟巨噬細(xì)胞進(jìn)行病毒分離[20]。分離后的病毒通常可以結(jié)合電鏡觀察、抗原抗體反應(yīng)、特異性核酸檢測、動物回歸試驗(yàn)等方法進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。傳統(tǒng)的病毒分離鑒定技術(shù)的結(jié)果雖然準(zhǔn)確可靠，但CDV易在外界環(huán)境中滅活，成功分離病毒到的難度很大，而且病毒分離培養(yǎng)及鑒定工作量較大，對試驗(yàn)條件要求較為苛刻，因此該方法不適于CDV的快速診斷，尤其不利于在基層CDV診斷工作中推廣應(yīng)用。

2.2 血清學(xué)檢測方法 常用的檢測CDV的血清學(xué)方法有瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、血清中和試驗(yàn)(SN)、免疫熒光抗體法、膠體金試紙條、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。免疫熒光技術(shù)可用于體外細(xì)胞培養(yǎng)物和患病動物臟器中的CDV檢測，是目前國際通用診斷CDV的手段[21]。Damián等[22](2005)采用免疫組化法對患肺炎的犬瘟熱病進(jìn)行檢測，認(rèn)為該方法是診斷犬呼吸系統(tǒng)疾病的組織病理學(xué)方法的有效補(bǔ)充手段。ELISA方法可用于評估犬瘟熱的免疫效果和疾病多方面的調(diào)查。Latha等[23](2007)用重組核蛋白建立了可在感染早期進(jìn)行CDV診斷IgM-ELISA方法。李娜等[24](2007)將CDV核蛋白基因表達(dá)產(chǎn)物(GST-N)作為診斷抗原，建立了間接ELISA檢測方法，重組核蛋白(GST-N)診斷抗原與常見的犬細(xì)小病毒陽性血清、犬副流感病毒陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有較好的特異性。An等[25](2008)利用獲得的2株單克隆抗體建立了膠體金試紙條診斷技術(shù)，并用巢式PCR進(jìn)行比較，雖然敏感性(89.7%和85.7%)和特異性(94.6%和100%)略低，但該試紙條使用方便，不需要特殊的儀器設(shè)備即可完成診斷，而且使用成本較為低廉，所以更容易在臨床上推廣。

2.3 分子生物學(xué)檢測方法 近年來，核酸雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)、限制性酶切片段長度多態(tài)性分析(RFLP)等分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用到CDV的診斷和疫苗毒與野毒株的區(qū)分中。Gaedke等[26](1997)用地高辛標(biāo)記制作了針對CDV N基因的核酸探針，建立了CDV核酸探針原位雜交檢測技術(shù)，原位雜交試驗(yàn)結(jié)果表明，單鏈RNA探針是目前檢測組織中CDV RNA最敏感的探針。Stanton等[27](2002)應(yīng)用半巢式PCR方法和免疫熒光法、病理組織學(xué)方法及免疫組化法比較，發(fā)現(xiàn)半巢式PCR方法更適于發(fā)病后的檢測，能夠在某種程度上區(qū)別疫苗株和流行株。SaitoTB等[28](2006)利用RT-PCR方法檢測具有犬瘟熱腦炎臨床癥狀的犬的尿液，發(fā)現(xiàn)RT-PCR檢測尿液樣本比血清和白細(xì)胞更為敏感。Cho等[29](2005)采用RT-LAMP技術(shù)檢測CDV基因組，以RT-PCR相對比，敏感性達(dá)100%，特異性為93.3%，但其檢測時間更短，僅用1h，還可以進(jìn)行位點(diǎn)檢測。劉彩玉等[30](2011)根據(jù)GenBank中犬瘟熱病毒H基因保守序列設(shè)計(jì)合成了內(nèi)外2對引物，成功建立了犬瘟熱病毒的RT-LAMP檢測方法。該方法在60℃下50 min即可完成，與常規(guī)RT-PCR檢測方法相比靈敏度高100倍。Wang F等[57](2011)使用的BamHI 限制性內(nèi)切酶對CDV的核蛋白(N)基因的保守區(qū)進(jìn)行RFLP分析，建立了區(qū)分CDV疫苗株與野毒株的RT-PCR-RFLP方法，并對中國毛皮動物中分離的CDV進(jìn)行了親緣關(guān)系分析。Yi L等[58](2012)建立了區(qū)分犬瘟熱病毒疫苗和野毒感染的聯(lián)合特異性RT-PCR技術(shù)，并對七個CDV中國株的血凝素基因進(jìn)行了遺傳特性分析，發(fā)現(xiàn)目前在中國家犬中流行的CDV是Asia1型。

3 問題與展望

隨著我國犬、水貂，狐貍等大型養(yǎng)殖場的建立，在犬和毛皮動物中犬瘟熱臨床病例的數(shù)量迅速增加，目前犬瘟熱已成為危害寵物業(yè)和特種經(jīng)濟(jì)動物養(yǎng)殖業(yè)最大的一種病毒性傳染病。由于CDV傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高，感染會引起包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和胃腸道消化系統(tǒng)在內(nèi)的全身性疾病，一旦發(fā)病，難以有效地治療和控制。因此，建立有效的檢測手段，開展犬瘟熱流行病學(xué)監(jiān)測，及時研發(fā)有效的疫苗、高免血清等生物制品是重要的發(fā)展方向。

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（2014–06–08）

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1007-1733(2014)08-0096-04