原料乳細菌總數快速檢測方法研究進展

孟憲梅，楊志國，孫肖明

（1.吉林工商學院，吉林長春130062；2.糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室，吉林長春130062；3.吉林市太太食品有限責任公司，吉林吉林132011）

原料乳細菌總數快速檢測方法研究進展

孟憲梅1，2，楊志國3，孫肖明1，2

（1.吉林工商學院，吉林長春130062；2.糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室，吉林長春130062；3.吉林市太太食品有限責任公司，吉林吉林132011）

概述了原料乳細菌總數快速檢測方法的研究現狀及最新研究進展，對電導微生物技術、PCR技術、ATP生物發光技術、流式細胞技術、直接表面熒光過濾技術、酶聯免疫法、生物傳感器法、智能化圖像識別技術進行了歸納，并對國內的研究方向進行了展望。

原料乳；細菌；快速檢測

原料乳營養豐富，是細菌良好的培養基，在擠乳、收集、貯藏、運輸的過程中極易污染細菌。目前我國乳品企業應用的細菌檢測方法，主要有培養法和染色法兩種，雖然具體操作程序有所不同，但是都存在著耗時、費力、操作繁瑣等不足，影響著企業對原料乳品質的正確判別和生產。因此準確、快速、容易操作的細菌快速檢測方法正在成為乳品企業關注的重點，直接決定著企業產品品質與綜合競爭力的提升。本文綜述了目前世界乳品領域內應用較為成熟的檢測方法，并對各種方法進行對比，同時也對正在進行研究的最新檢測手段進行介紹。

1 電導微生物技術

該技術的工作原理是基于微生物生長導致樣品電導率的變化，其方便之處在于，只要樣品本身是液態就可以直接注入培養瓶中不需要經過稀釋。微生物在培養過程中，使得液態樣品中的糖類發酵成乙酸、乳酸等，蛋白質變成氨基酸，由不導電的大分子變成導電小分子，從而改變培養瓶中液體的電導率。電導率從基線到明顯增加的點，稱為檢測時間，檢測時間長短與液態培養物中微生物總數多少關系密切，數量越多，檢測時間越短，數量越少，檢測時間就越長[1]。劉玲君等[2]應用英國的MALTHUS微生物快速分析儀，電熱恒溫培養箱等對100個污染度梯度不同的原料乳樣品進行檢測，同時用平皿計數法進行對照。結果表明方法可行，且具有測定結果更快捷、省力。由于資料收集自動進行，測試可以不間斷，使原料奶得以更及時、更快的監測，具有傳統平皿計數法測試所不能比擬的優點。但是當檢測樣品中含菌量少的樣品時需要時間長（16 h～20 h），并且設備昂貴，難以普及是該種技術方法目前存在的缺點。

2 PCR技術

2.1 熒光定量PCR技術

熒光定量PCR技術是一種目前國內外應用較為廣泛的定量PCR技術，是通過始點定量和熒光檢測系統實時監測累積熒光強度而實現的，具有靈敏度高、特異性強、線性關系好、操作簡單等優點[4]。楊君[5]等采用收集離心后的細菌沉淀加入裂解液，煮沸裂解后獲取細菌DNA，然后應用熒光定量PCR法擴增檢測細菌總數，全程耗時僅1 h～2 h，與該試驗進行對比的包括傳統的國標平板培養計數法和3M培養法，結果顯示，通過熒光定量PCR技術進行細菌總數的檢測操作方便、靈敏、檢出限低，雖然該方法與國標培養定量法所得實驗數據存在差異，但是都在可接受的實驗誤差范圍內，可應用在原料乳細菌總數的快速檢測中。

2.2 多重PCR技術

多重PCR是指在一個PCR反應體系中加入多對特異性引物，然后針對多個DNA模板或同一模板的不同區域擴增多個目的片段的PCR技術[6]。在污染食品的致病菌中常見的有沙門氏菌、單增李斯特菌、金葡菌等，主要通過食品、飲水感染人類，導致細菌性食物中毒。武衛影等[7]應用三重PCR技術將食品中常見的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌經6 h～8 h內快速檢出，為3種食源性致病菌檢測試劑盒的研發奠定了基礎。BaiY（2013年）等[8]應用氨基修飾硅殼磁性納米顆粒（ASMNPs）結合多重PCR（M-PCR）對人為污染腸炎沙門氏菌和李斯特的原料奶進行檢驗，其敏感程度已經達到15CFU/mLand 25CFU/mL。

3 ATP生物發光技術

ATP存在于包括細菌在內的一切活體細胞組織中，當熒光酶系統和ATP接觸時就會發光，且光的強度與細菌的ATP含量成正比，這為快速檢測樣品中是否存在細菌提供了非常有利的依據[9-10]。田麗萍[11]曾用ATP生物發光技術與丹麥福斯的FOSS細菌總數測測定儀進行原料乳中細菌總數的檢測比較，在25℃條件下，采用BLW 0401微量光度計，將細菌細胞通過裂解劑裂解從而釋放其中的ATP，并應用熒光素酶進行檢測，得到與細菌細胞數對應的發光值。從試驗結果可知，ATP生物發光技術與FOSS細菌總數測定儀在檢測原料乳細菌總數方面存在較高相關性（R2=0.905 3）。該技術能夠在2min～5min內快速檢出原料乳中的細菌總數，且成本低廉，值得推廣。Sharpe等[12]也經過多次重復試驗，證明了ATP生物發光技術在快速檢測原料奶細菌總數方面確實可靠。李春艷[13]等將ATP生物發光法進行試驗的結果是，乳中微生物總數與光值呈正的直線相關（r=0.948 5），相關程度為顯著相關（P＜0.001），線性回歸方程為：y=1.049 6x+2.4。同時與平皿培養法檢測結果做比對，結果表明兩種方法顯著相關。

4 流式細胞技術

流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）是一種對液流中排成單列的細胞或其它生物微粒（如微球，細菌，小型模式生物等）逐個進行快速定量分析和分選的技術[14]。該技術無需對樣品進行培養可直接檢測樣品中細菌的性質和數量，同時具有高度敏感和應用廣泛以及節省時間等優點。主要原理是讓帶菌的樣品流經流式細胞儀小孔，通過檢測細菌細胞與周圍介質的電傳導率的差異；或選用激光為發光源將聚焦后的光束垂直照射到樣品流上，分析光的散射情況；或用熒光物質標記細胞，檢測熒光信號。光的散射代表著細胞體積的大小，熒光信號的強度則反映了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內物質的濃度，由此來定性和定量地判別微生物[15]。該技術早在1997年由Zee H[16]曾經在UHT的加工過程中有過應用報道。Pettipher[17]等（2005年），使用FCM快速檢測牛奶中污的細菌數量，并取得了較為理想的實驗效果。但缺點是設備昂貴。現在應用最多的是產品有丹麥福斯公司研制的FOSS細菌總數測測定儀（BactoScan FC）。

5 直接表面熒光過濾技術

直接表面熒光過濾技術（Direct Epifluorescent Filter Technique DEFT）是一種直接測定樣品中細菌總數的快速檢測法，可用于檢測樣品中活菌數量，由英國科學家Pettipher[18]設計開發，最初的目的是為了檢測牛奶樣品。其工作原理為吖啶橙染料以單體形式與雙股DNA結合，經熒光顯微鏡觀察可見出綠色熒光；以多體形式與單股DNA結合，經熒光顯微鏡觀察橙色或者橙黃色熒光，而單股DNA只存在于活細胞中，因此可通過光的顏色判定樣品是否存在活菌，并且通過表面熒光顯微鏡對具有熒光的細菌進行計數。試驗證明[19]，該種方法測得樣品細菌總數與傳統的國標平板培養計數結果相符，相關系數為0.81～0.91。

DEFT計數能在24 h內預測5℃和11℃下保存的巴氏殺菌乳的質量是否一致每個樣品的檢測時間約25min費用為1美元。缺點是由于熒光抗體能與食品中固有微生物發生非特異性反應因此在使用DEFT技術時有可能獲得假陽性結果，熒光顯微鏡、圖象分析儀等設備昂貴。

6 酶聯免疫法

酶聯免疫法（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay，ELISA）是將抗原或抗體結合到某種固相載體表面，把受檢標本測定其中的抗體或抗原和酶標抗原或抗體與固相載體表面的抗體或抗原反應，加入底物顯色后，根據顏色反應的深淺進行定性或定量分析[20]。鄢志剛等[21]用單抗直接ELISA、PCR法分別對海地區5個牛場原料奶，采146份樣品進行沙門氏菌檢測，并用國標方法進一步驗證，結果顯示，直接ELISA法檢測15個陽性樣品，131個陰性；PCR法和國標法檢測出的結果都是12個陽性。最終發現直接ELISA法的敏感性達100%，特異性很高，與國標復合率超過90%。是對大量樣品進行粗選較好的選擇。楊愛萍等[22]用單抗酶聯試劑盒與PCR法快速檢測沙門氏菌，結果也證實了ELISA法檢測靈敏度高，特異性強，并且假陽性率一般在2.5~3之間，且可在短時間內快速篩去大量陰性樣品。

7 生物傳感器法

生物傳感器是小型、便攜的分析裝置，它是將具有分子識別功能的生物識別元件和信號放大轉換元件緊密結合的分析裝置[23]。其工作原理是將待測物質與某種生物活性物質發生反應所產生的信號，經由換能器轉換成為電子信號，再將該信號經放大器放大輸出，從而反應出待測物質的濃度信息[24]。盧智遠等[25]應用色素還原試驗法的原理，利用自制的電化學生物傳感器，對細菌在氧化還原過程中生成的電子數進行計測，最終測定乳制品中的細菌總數，該方法快速有效且能確定總量。但是由于生物本身具有不穩定性，經由傳感器放大后的可檢測信號波動較大，所以在具體應用中容易出現檢測結果的偏差。

8 智能化圖像識別技術

該技術是完全本土化的，由中國農業機械化科學研究院研發的一種快速原料奶細菌總數檢測系統。目前該技術還沒有在國外應用于乳業的資料，是一種新的嘗試。其過程為首先通過生物顯微鏡和數碼圖像裝置獲取原奶中細菌的數字化圖像，然后交由計算機存儲，再由專門的智能圖像識別系統將圖像特征提取，與數據庫中原有的標準特征圖像進行對比分析，最終檢測出細菌總數，也可進一步判斷細菌的類別[26]。智能化圖像識別系統優點是其檢測過程具有良好的直觀性，是真正的直接檢測。不過，在細菌顯微圖象的轉換和計算機識別與計數環節，還需要開發專門的智能軟件。將整個過程進一步簡化、易于操作，結果更加可靠。

9 結束語

原料乳細菌總數的檢測方法很多，包括傳統檢測方法和正在研究中的快速檢測方法，每種方法都存在著自身的優缺點，人們在充滿期待的同時，目前應用較多的還是傳統的標準平板計數法。一種快速檢測方法是否可以廣泛推廣，應該從一下幾個標準去判斷：人力，是指檢測是否可以實現自動化，檢測設備操作是否繁瑣復雜；財力，是指檢測設備的資金投入與每次檢測所需費用，是否能夠被乳品企業接受，成本核算是否合理；時間，是指每次檢測從樣品處理到分析結果最終確定消耗的時間，是否能夠達到在線檢測標準；可靠程度，是指最終結果的準確度是否符合該樣品相關指標檢測要求。從目前發表的各種研究報告可以發現，世界發達國家從20世紀60-70年代就已經在實際生產中開始應用快速檢測技術，而我國由于乳用動物的養殖比較滯后，除了沿用傳統的方法進行細菌檢測，多數企業還是依靠從國外進口設備和儀器來實現快速檢測。因此加快快速檢測的研究步伐，達到世界先進水平是當下國內科研工作者的當務之急。

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Research Progress on Rapid Detection of Total Quantity of Bacteria in Raw M ilk

MENGXian-mei1，2，YANG Zhi-guo3，SUNXiao-ming1，2

（1.Jilin Business and Technology College，changchun 130062，Jilin，China；2.Key Laboratory of Grain and Oil Processiong of Jinlin Province，changchun 130062，Jilin，China；3.Mrs Food limited liability company of Jilin City，Jilin 132011，Jilin，China）

The current research status and the latest research progress on rapid detection of total quantity of bacteria in Raw Milk were reviewed.The methods of rapid detection for total quantity of bacteria included conductancemicrobiology technique，PCR，ATP bioluminescence technique，flow cytometry，directepifluorescent fiIter technique，enzyme-linked immunosorbentassay、biosensormethod，intelligentimage recognition technique．Finally，thedomestic developmentdirectionofcorrelated researchworkwasalsoprospected.

rawmilk；bacteria；rapid detection

蔣偉.流式細胞術測定漢灘病毒滴度方法的建立[D].第四軍醫大學,2011.

10.7666/d.d220428

2014-06-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.038

吉林省科技發展計劃項目（201205054）；糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室開放資金項目（2014001）

孟憲梅（1964—），女（漢），教授，碩士生導師，博士，研究方向：食品安全及食品生物技術。