青海高原鼠疫菌DFR分型及空間分布特征的研究

楊曉艷，魏柏青，辛有全，靳 娟，何 建，熊浩明，魏榮杰，祁美英，李存香，金 泳，代瑞霞

青海省自1954年證實存在鼠疫自然疫源地以來，全省有33個縣(市)、119個鄉(xiāng)(鎮(zhèn))被確定為鼠疫疫源地，疫點695處，疫源面積近20萬km2。青海高原鼠疫自然疫源地是目前我國動物間和人間鼠疫流行最嚴重的地區(qū)之一，至2012年的60年間，僅1984年、2007年、2008年和2012年無病例報告外，其余年間均有人間鼠疫發(fā)生。因此，迫切需要采用新的技術手段，針對這種具有重要公共衛(wèi)生意義的傳染病進行深入研究，掌握其遺傳變異的規(guī)律、形成機理以及地域和時空分布特征，為制訂有效的防治策略，鼠疫菌的分型、溯源以及保障國家生物安全奠定基礎。為此，作者對青海高原1954年以來分離的839株鼠疫菌采用DFR技術對其進行基因分型的研究。

1 材料與方法

1.1實驗菌株 共有839株鼠疫菌用于本研究。其中喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地829株，青海田鼠鼠疫自然疫源地10株。這些菌株涵蓋了青海高原鼠疫疫源地的不同時間、地區(qū)、宿主、媒介體內(nèi)分離的鼠疫菌，由青海國家鼠疫菌保藏中心提供。

1.2鼠疫菌DNA的提取 將鼠疫菌培養(yǎng)于赫氏瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，DNA提取按照經(jīng)典的苯酚-氯仿混合抽提法進行[1]。

1.3引物和PCR擴增方法 鼠疫菌差異區(qū)段(Different Region,DFR)分型，使用23個DFR和PMT1(質粒驗證引物)的擴增引物(引物序列參見文獻[2])。PCR反應體系：10×buffer 3 μL，10 mmol dNTP 0.1 μL, 5U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL, 10 μmoL引物對1 μL，模板DNA(2 ng/μL)5 μL, 用去離子水補足至30 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s共進行30個循環(huán)，最后72 ℃終延伸3 min。PCR產(chǎn)物檢測：擴增結束后取10 μL產(chǎn)物進行濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳，用goldview 染料進行染色，紫外燈下記錄結果，陽性結果記錄為“1”，陰性結果記錄為“0”。每次PCR檢測均設陰性對照(用去離子水取代模板)和陽性對照(模板為鼠疫菌菌株82009和620024 DNA的混合物，包括24個DFRs)。可疑PCR結果和陰性PCR結果至少重復1次。

1.4地理信息系統(tǒng)(GIS) 運用青海省地方病預防控制所地理信息系統(tǒng)(GIS)[3]進行鼠疫菌基因型空間分布特征的分析。

2 結 果

2.1青海省鼠疫菌的基因分型 青海高原存在2種類型的鼠疫疫源地。被試的839株菌，共發(fā)現(xiàn)有11個基因組型。檢索包含909株中國鼠疫菌自然分離菌株的DFR分型數(shù)據(jù)庫[2]，有8個基因組型與其相同，分別為1b、5、7、8、10、14、21、30型等基因組型，同時我們還發(fā)現(xiàn)了3個新的基因組型，即32、44、36。32型與5型接近，但32型缺失了DFR18；44型與8型接近，44型也缺失DFR18；36型亦與5型接近，但與5型相比缺少DFR10和DFR18。青海高原喜馬拉雅旱獺鼠疫疫源地以5、8型為主，青海高原青海田鼠鼠疫疫源地鼠疫菌基因組型為14型。青海省鼠疫菌株23個DFR和PMT1(質粒驗證引物)分布見表1。

表1 24個DFR在青海省791株鼠疫菌中的分布狀態(tài)

Note: “1” means PCR amplification showed positive; “0”means PCR amplification showed negative.

2.2鼠疫菌基因型的空間分布特征 青海省鼠疫疫源地所分離的鼠疫菌基因型具有一定的地理分布特征，8型菌株的分布區(qū)為祁連山南麓、青海湖環(huán)湖地區(qū)、青海南山的祁連、門源、剛察、海晏、共和、天峻、烏蘭和宗務隆山的德令哈等地區(qū)，占56.14%(471/839)；5型菌株分布于青南高原的玉樹、雜多、治多、稱多、囊謙、曲麻萊和海西西部的格爾木等地區(qū)，占23.12%(194/839)；1b型菌株分布于冷湖、烏蘭、澤庫；7型菌株分布于循化、同仁、澤庫、德令哈、囊謙；32型菌株分布于格爾木的唐古拉地區(qū)；44型菌株分布于祁連、門源；36型菌株分布于囊謙；唯獨囊謙地區(qū)有10型分布，其菌株分離自2004年一次肺鼠疫流行中的尸體和病人。在稱多縣青海田鼠分布區(qū)，鼠疫菌基因型屬于14型，占1.19%(10/842)。見表2。

表2 青海高原鼠疫耶爾森菌基因組型的地區(qū)分布

Note:Focus C--Marmothimalayanplague foci; Focus M--Microtusfuscusplague foci

3 討 論

周冬生等[4]人利用全基因組芯片比較基因組學的研究獲得了鼠疫菌22 個差異區(qū)段(DFR)，并將我國各鼠疫自然疫源地分離的 260 株鼠疫菌分成14 個基因組型。之后，軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所又通過消減雜交技術發(fā)現(xiàn)了新的差異區(qū)段，并使用23個DFR的擴增引物，對分離自我國的909株鼠疫菌進行了DFR分型，將909株中國鼠疫菌分離株分成32個基因組型，根據(jù)疫源地與宿主的分布規(guī)律，提出了主要基因組型和次要基因組型的概念，前者與鼠疫菌在自然疫源地中的演化密切相關。因此，隨著盡可能多的DFR的發(fā)現(xiàn)，DFR分型方法會日趨完善。

青海省青海田鼠鼠疫自然疫源地是近年來新發(fā)現(xiàn)的一塊疫源地[5]，青海田鼠是主要儲存宿主，細鉤黃鼠蚤和直緣雙蚤指名亞種為主要傳播媒介。分布于青海省稱多縣珍秦鄉(xiāng)境內(nèi)，與四川省石渠縣接壤。截止目前青海田鼠鼠疫疫源地內(nèi)分離到的10株鼠疫菌均為14型。

青海省喜馬拉雅旱獺鼠疫疫源地內(nèi)鼠疫菌基因型比較復雜，以5、8型為主。5型多分布在青海的青南高原和海西西部地區(qū)； 8型菌株的分布區(qū)為祁連山南北麓、青海湖環(huán)湖地區(qū)及青海南山和宗務隆山等地區(qū)；8型和5型的交匯處常同時有2～3種基因型的流行； 2004年青海省囊謙縣肺鼠疫暴發(fā)流行時所分離的8株菌株其基因組型全部為10型。新發(fā)現(xiàn)的3個基因組型，32型菌株分布于格爾木的唐古拉地區(qū)；44型菌株分布于祁連、門源；36型菌株分布于囊謙。由于青海高原地形復雜，自然景觀垂直成帶十分明顯，景觀特征的多樣性使得地區(qū)間生態(tài)系差異較大，草甸草原幾乎占據(jù)整個青海；森林草甸草原出現(xiàn)于祁連山東部、玉樹東南部；昆侖山—阿爾金山山地以干旱的高山草原為主，鼠疫菌為了適應不同的自然景觀，基因組型發(fā)生變化也就不可避免。

參考文獻：

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