犬源大腸桿菌分離鑒定及耐藥性分析

趙相勝，孫 洋，紀(jì) 雪，劉 軍，祝令偉，佟盼盼，馮書章

隨著國民生活水平的提高及生活習(xí)慣的變化，寵物犬的數(shù)量日益增加。與家畜和多數(shù)經(jīng)濟(jì)動物相比，犬與人的接觸更為密切，生活周期更長，這些都增加了人獸共患病原體在人犬之間傳播的風(fēng)險(xiǎn)。為控制細(xì)菌性感染，寵物臨床上廣泛使用抗菌藥物，濫用和不合理使用抗生素的問題日益嚴(yán)重，并由此導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的增加與擴(kuò)散。寵物細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生不僅會影響治療效果，更嚴(yán)重的是增加了寵物耐藥菌傳給人類的風(fēng)險(xiǎn)。鑒于此，近年來一些發(fā)達(dá)國家對犬的臨床耐藥菌的問題越來越重視[1-3]，我國也開始了這方面研究[4-5]。

本研究對東北地區(qū)犬?dāng)y帶的大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定和耐藥性分析，提供了該地區(qū)犬源耐藥性大腸桿菌的流行病學(xué)本底，為臨床上正確選擇抗菌藥物、防治犬細(xì)菌性疾病提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為深入研究耐藥性的水平傳播機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1樣品來源 2012年至2013年于吉林省1家寵物醫(yī)院、2家寵物門診和某軍犬基地共采集191份犬肛拭子樣品。

1.2試劑及培養(yǎng)基 氯霉素、四環(huán)素、氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松、美洛培南、慶大霉素、復(fù)方新諾明、阿米卡星、多黏菌素B、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星藥敏片購自O(shè)xoid公司；麥康凱瓊脂購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌定位顯色培養(yǎng)基購自法國科瑪嘉公司；MH瓊脂購自法國梅里埃公司；大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC25922由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3大腸桿菌分離鑒定 向有肛拭子樣品的采集管中加入2 mL 0.85%生理鹽水，室溫振蕩混勻10 min，靜置3 min，吸取10 μL上清用接種環(huán)劃線于麥康凱顯色培養(yǎng)基平板上，37℃溫箱培養(yǎng)過夜。挑取可疑紅色菌落于大腸桿菌定位顯色培養(yǎng)基劃線純化及鑒定。

1.4大腸桿菌分群鑒定 采用PCR方法對分離到的大腸桿菌進(jìn)行分群鑒定，實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[6]，可將大腸桿菌分為A、B1、B2、D共4個(gè)群。大腸桿菌分群引物由invitrogen公司合成。

1.5藥物敏感性檢測 采用半定量瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)法，按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)推薦的操作程序進(jìn)行[7]，同時(shí)用大腸桿菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌株，參照CLSI的標(biāo)準(zhǔn)判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)。多粘菌素的耐藥判斷按照丹麥細(xì)菌耐藥監(jiān)測系統(tǒng)(DAN-MAP)所使用的標(biāo)準(zhǔn)[8]。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)菌分離鑒定 共分離到的254株大腸桿菌隨機(jī)挑取10株菌進(jìn)行16sDNA測序，BLAST比對結(jié)果全部為大腸桿菌，證明麥康凱顯色培養(yǎng)基和科瑪嘉定位顯色培養(yǎng)基對大腸桿菌的特異性分離鑒定是可靠的。

2.2大腸桿菌分群 254株犬大腸桿菌多重PCR分群(圖1)結(jié)果為：A群：117株；B1群：48株；B2群：36株；D群：53株。結(jié)果顯示屬A群的分離株較多，D群次之，B1、B2數(shù)目基本相當(dāng)。一般認(rèn)為B2和D群多屬致病性的大腸桿菌[6]，這兩群大腸桿菌占總分離數(shù)的35.04%。從表2可以看出，腹瀉或者其他疾病病犬大腸桿菌分離株致病群的比例顯著高于臨床健康犬。

表1 大腸桿菌分群引物

表2 犬源大腸桿菌分離株分群結(jié)果

注：括號內(nèi)為B2群和D群分離株所占百分比。

Note: The percentage of isolates of B2 group and D group are in the brackets.

2.3藥物敏感性實(shí)驗(yàn) 犬源大腸桿菌分離株對氨芐西林和阿米卡星的耐藥率最高，分別為75.98%和77.56%，對四環(huán)素的耐藥率也達(dá)到68.90%，對美洛培南和多粘菌素B耐藥率最低，分別為3.54%和3.94%。對其它抗生素耐藥率在30%～60%之間。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明(表3)，分離于寵物醫(yī)院樣品的大腸桿菌對所測試的13種抗生素的耐藥率均高于寵物門診樣品的分離株，軍犬的耐藥率最低。通過表4可以看出，犬源大腸桿菌致病群(B2和D群)分離株對頭孢類抗生素的耐藥率均高于A和B1群，對其他類抗生素的耐藥譜無顯著差異。

表3 犬源大腸桿菌對抗菌藥物的敏感性

表4 犬源大腸桿菌藥物敏感性與分群的相關(guān)性

2.3耐藥譜分析 結(jié)果如表5所示，僅有8株分離株對13種藥物全部敏感(3.15%)，有14株菌只對一種抗生素耐藥，其余232株大腸桿菌表現(xiàn)為對2種以上抗菌藥物耐藥的不同多耐藥表型。1～3種抗生素耐藥菌株有59株(23.22%)；4～6種抗生素耐藥菌株有63株(24.8%)；7～9種抗生素耐藥菌株有58(22.8%)；10～12種抗生素耐藥菌株有68株(26.77%)。

表5 254株犬源大腸桿菌的耐藥模式

注：AM,氨芐西林；CTX，頭孢噻肟；CRO,頭孢曲松；CAZ,頭孢他啶；MEM,美洛培南；CN,慶大霉素；AN,阿米卡星；LEV,左氧氟沙星；CIP,環(huán)丙沙星；TE,四環(huán)素；SXT, 磺胺甲基異惡唑；CHL,氯霉素；PB,多粘菌素

Note: AM--Ampicillin; CTX--Cefotaxime; CRO--Ceftriaxone; CAZ--Ceftazidime; MEM--Meropenem; CN--Gentamicin; AN--Amikacin; LEV--Levofloxacin; CIP--Ciprofloxacin; TE--Tetracycline; STX--Sulfamethoxazole; CHL--Chloramphenicol; PB--Polymixin B.

測試的13種抗生素可歸為β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類、氯霉素類和多肽類抗菌藥物。多重耐藥表型一般定義為同時(shí)對≥3類抗生素耐藥，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明(圖1)，多重耐藥菌數(shù)達(dá)187株(73.62%)，耐6類抗生素的最多，占比例29.53%，所耐抗生素的種類是β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、喹諾酮類、氯霉素類和磺胺類藥物，有一株對7類抗生素均耐藥。多重耐藥菌株中最常出現(xiàn)的是β-內(nèi)酰胺類耐藥表型，為179株，占多重耐藥菌株的95.72%。

圖1犬源大腸桿菌分離株多重耐藥模式

Fig.1PatternsofmultipleresistancesofEscherichiacolistrainsisolatedfromdogs

3 討 論

本研究對我國東北地區(qū)犬源大腸桿菌的耐藥情況進(jìn)行了初步調(diào)查。實(shí)驗(yàn)選取對小動物臨床用藥頻率高，且具有代表性的13種抗菌藥物，囊括了β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類等7個(gè)大類。與國外研究結(jié)果相比，我國東北地區(qū)犬源大腸桿菌的耐藥率更高，耐藥譜更廣。多重耐藥菌的比例達(dá)到73%以上。對臨床常用藥物如氨芐西林、阿米卡星耐藥率均在70%以上，四環(huán)素和喹諾酮類藥物也達(dá)到60%左右。丹麥、葡萄牙、西班牙和瑞典等國家犬源大腸桿菌對絕大部分抗菌藥物的耐藥率都很低[2, 9-11]。丹麥健康犬肛拭子采集的大腸桿菌全部對頭孢噻呋、慶大霉素和環(huán)丙沙星敏感，耐藥率最高的是鏈霉素為9%。瑞典的犬源大腸桿菌對恩諾沙星的耐藥率為9%，對四環(huán)素和慶大霉素的耐藥率分別為7%和1%，對氨芐西林的耐藥率最高，為17%。西班牙健康犬糞便中分離的大腸桿菌大約有20%對四環(huán)素耐藥、12%對氨芐西林耐藥、15%對鏈霉素耐藥，但對頭孢他啶、頭孢噻吩和阿米卡星敏感。比較可以看出，不同國家的寵物源大腸桿菌的耐藥性差別較大，但基本上對氨芐西林、磺胺類藥物、四環(huán)素等臨床使用率高的藥物耐藥性較高，對頭孢菌素類、氟喹諾酮類藥物和阿米卡星等藥物相對較敏感，而本研究這些種類的抗生素耐藥率均明顯高于國外。據(jù)2010年韓國的一項(xiàng)報(bào)道[3]，犬大腸桿菌分離株對藥物的敏感率流浪犬分離株為38.4%、寵物醫(yī)院分離株為26.7%，而本研究結(jié)果是對受試抗菌藥物全部敏感的菌株只有3.15%，說明我國犬源大腸桿菌的耐藥問題相當(dāng)嚴(yán)重。

本研究發(fā)現(xiàn)，與寵物犬相比，軍犬?dāng)y帶大腸桿菌的耐藥率較低，耐藥譜較窄，這在一定程度上與軍犬規(guī)范用藥和環(huán)境衛(wèi)生相關(guān)。另外，寵物門診的樣品分離株耐藥率低于寵物醫(yī)院的分離株，而兩者之間分群結(jié)果差異不大。

伴侶動物耐藥菌產(chǎn)生與流行的問題已得到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[12]，抗生素用于伴侶動物的模式與畜禽的用藥模式相比明顯不同，前者與人類治療疾病的模式有更多的相同點(diǎn)[13-14]。這提示伴侶動物耐藥菌的形成與人類耐藥菌的形成存在著某些共性，孕育著動物與人耐藥性傳播或互傳的風(fēng)險(xiǎn)。耐藥基因在犬和人類之間傳播的報(bào)道也日益增多[15-16]，耐藥菌可能直接通過犬傳播給人，也可能通過環(huán)境在共同生活的人和寵物之間相互傳播[17]。與其他國家相比，我國犬源耐藥菌的問題更為嚴(yán)重。研究結(jié)果顯示一些分離株對用于醫(yī)學(xué)臨床治療的三代、四代頭孢、喹諾酮類、甚至碳青霉烯類抗生素已經(jīng)產(chǎn)生多重耐藥表型，這是非常令人擔(dān)憂的，也提醒我們對伴侶動物應(yīng)該規(guī)范使用抗生素，以免造成更為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。對于伴侶動物細(xì)菌耐藥性的問題應(yīng)引起足夠的重視，積極開展寵物源細(xì)菌進(jìn)行耐藥性監(jiān)測，并制訂抗菌藥物的使用規(guī)范。

參考文獻(xiàn)：

[1]NORM/NORM-VET 2006. Usage of antimicrobial agents and Occurrence of antimicrobial resistance in Norway[EB/OL]. [2013-09-01]http://www.vetinst.no/nor/content/download/531/4382/file/NORM%20NORM-VET%202006.pdf, 2006.

[2]SVARM 2006. Swedish Veterinary Antimicrobial Resistance Monitoring [EB/OL]. [2013-09-01]http://www.sva.se/upload/Redesign2011/Pdf/Om_SVA/publikationer/Trycksaker/1/svarm2006.pdf

[3]Nam H, Lee H, Byu J, et al. Prevalence of antimicrobial resistance in fecalEscherichiacoliisolates from stray pet dogs and hospitalized pet dogs in Korea[J]. Microb Drug Resist, 2010, 16(1): 75-80. DOI: 10.1089/mdr.2009.0125

[4]Shi ZH, Wang WJ, Lan YL, et al. Analysis of antibiotic resistance ofEscherichiacoliisolate from pets[J]. China Anim Husband Vet Med, 2012, 39(7): 244-245. (in Chinese)

師志海, 王文佳, 蘭亞莉, 等. 寵物源性大腸桿菌耐藥性調(diào)查[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2012, 39(7): 244-245.

[5]He L, Sun Y, Lei T, et al. Investigation of drug-resistant ofEscherichiacoliisolate from pets[J]. Chin J Vet Med, 2009, 45(8): 28-30. (in Chinese)

何柳, 孫艷, 雷濤, 等. 寵物源性大腸桿菌耐藥性調(diào)查[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2009, 45(8): 28-30.

[6]Olivier C, Ste Phane B, Edouard B. Rapid and simple determination of theEscherichiacoliphylogenetic group. applied and environmental microbiology[J]. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(10): 4555-4558.

[7]Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Twenty-Second informational Supplement[S]. Wayne: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012.

[8]DANMRP. DANMAP 2006-consumption of antimicrobial agents and occurrence of antimicrobial resistance in bacteria from food animals, food and humans in Denmark [EB/OL]. [2013-09-01]. http://edit.ssi.dk/sitecore/shell/Controls/Rich%20Text%20Editor

/～/media/FFEF2D0F8D2E4B81AB228DAB8456ED75.ashx

[9]Johnson JK, Perencevich EN, Lincalis DP, et al. Dog bite transmission of antibiotic-resistant bacteria to a human[J]. Infect Control Hosp Epidemiol, 2006, 27(7): 762-763.

[10]Costa D, Poeta P, Saenz Y, et al. Prevalence of antimicrobial resistance and resistance genes in faecal Escherichia coli isolates recovered from healthy pets[J]. Vet Microbiol, 2008, 127(1/2): 97-105. DOI: 10.1016/j.vetmic.2007.08.004

[11]Damborg P, Srensen AH, Guardabassi L. Monitoring of antimicrobial resistance in healthy dogs: First report of canine ampicillin-resistantEnterococcusfaeciumclonalcomplex 17[J]. Vet Microbiol, 2008, 132(12): 190-196. DOI: 10.1016/j.vetmic.2008.04.026

[12]Scott WJ. Antimicrobial resistance in companion animals[J]. Anim Health Res Rev, 2008, 9(2): 169-176. DOI: 10.1017/S1466252308001485

[13]Prescott JF, Baggott JL, Walker RD. Antimicrobial therapy in veterinary medicine[M]. 3rded. Ames: Iowa State University Press, 2000: 537-545.

[14]DeVincent SJ, Reid-Smith R. Stakeholder position paper: companion animal veterinarian[J]. Prev Vet Med, 2006, 73(2-3): 181-189. DOI: 10.1016/j.prevetmed.2005.09.015

[15]Guardabassi L, Schwarz S, Lloyd DH. Pet animals as reservoirs of antimicrobial-resistant bacteria[J]. Antimicrob Chemother, 2004, 54(2): 321-332. DOI: 10.1093/jac/dkh332

[16]Simjee S, White DG, McDermott PF, et al. Characterization of Tn1546 in vancomycin-resistantEnterococcusfaeciumisolated from canine urinary tract infections: evidence of gene exchange between human and animal enterococci[J]. Clin Microbiol, 2002, 40(12): 4659-4665. DOI: 10.1128/JCM.40.12.4659-4665.2002

[17]Pedersen K, Pedersen K, Jensen H, et al. Occurrence of anti-microbial resistance in bacteria from diagnostic samples from dogs[J]. J Antimicrob Chemother, 2007, 60(4): 775-781. DOI: 10.1093/jac/dkm269