抗蚜基因及其轉基因作物研究進展

陳勁劉志朱生偉

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，長沙 410128；2.中國科學院植物研究所 植物分子生理學重點實驗室，北京 100093）

抗蚜基因及其轉基因作物研究進展

陳勁1劉志1朱生偉2

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，長沙 410128；2.中國科學院植物研究所 植物分子生理學重點實驗室，北京 100093）

普遍且頻繁發生的蚜蟲危害給農業生產造成嚴重損失。就抗蚜蟲基因工程研究取得的進展進行綜述，分析目前克隆的抗蚜基因及其獲得的轉基因作物，并討論轉基因抗蚜中存在的問題，探討通過新的毒殺基因克隆、基因定點突變、增加表達調控元件及利用凝集素蛋白作為運輸載體等方法來提高抗蚜效果，為今后抗蚜轉基因作物育種研究提供參考。

蚜蟲 抗蚜基因 基因工程 轉基因作物

蚜蟲（Lipaphiserysimi），又稱為膩蟲或蜜蟲，屬于半翅目（Hemiptera）（原為同翅目Homoptera），分為球蚜總科（Adegoidea）和蚜總科（Aphidoidea）兩大類。目前世界上已知的蚜蟲種類有4 700余種，我國現已發現的約有1 000余種［1］。蚜蟲以刺吸式口器從植物幼嫩莖、葉和嫩穗部位大量地吸取植物的營養成分，導致植物營養惡化，并引起植物葉片皺縮。同時，蚜蟲分泌蜜露覆蓋在植物葉片表面，可引起霉菌滋生，嚴重影響植物的呼吸作用和光合作用，致使作物產量下降［2，3］。另外，蚜蟲還傳播植物病毒，對農業生產造成的損失與蚜蟲直接為害相比更為嚴重［4］。

由于蚜蟲為害的普遍與頻繁發生，蚜蟲的有效防治一直是困擾農業生產的難題。目前主要采取藥物防治、生物防治和植物基因工程防治等方法對蚜蟲進行防治。農藥防治具有見效快、使用方便的特點，但農藥不僅污染環境，而且其殘余會對人畜安全造成隱患，因而減少農藥的使用已成為必然趨勢。生物防治是利用蚜蟲天敵或蚜蟲報警信息素來防治蚜蟲，由于受到一定環境條件的限制，效果不穩定。植物轉基因技術的日趨成熟，使抗蚜基因工程成為防治蚜害的一條有效途徑。目前已經克隆得到了大量的抗蚜蟲相關基因，通過轉基因技術將一些抗蚜蟲基因轉入了作物中，并在提高外源基因的表達及防止蚜蟲產生抗性方面取得了一定的進展。

1 抗蚜基因與轉基因抗蚜作物

到目前為止，已從動物、植物及微生物中鑒定出了大量具有抗蚜效應的基因，這些基因總體來說

可分為特異性抗蚜和廣譜抗蚜兩類。特異性抗蚜基因只在同屬或是同種植物中才會表現出抗蚜作用，且這類基因只對特定的某種或幾種蚜蟲有效果，因此將此類基因轉入其他植物中通常得不到理想的抗蚜效果。目前克隆得到的特異性抗蚜基因主要有Mi-1.2［5，6］、Rag［7］、Vat［8］、Sd1［9］等，在這些基因的轉基因植物的抗蚜效果中，僅Mi-1.2基因表現出了較高抗蚜活性，其余幾個抗蚜基因的效果均不理想。由于特異性抗蚜基因的抗蟲譜窄，因此應用價值有限。

廣譜抗蚜基因在多種植物中對多種蚜蟲均有較好抗性，它能干擾蚜蟲的生長發育或是影響蚜蟲的營養吸收及代謝，從而達到抗蚜目的，但其具體作用機制還有待于進一步研究。目前克隆到的廣譜抗蚜基因主要包括細胞分裂素基因［10，11］、蛋白酶抑制劑基因［12，13］、植物凝集素基因以及少數幾種Bt基因。目前，在植物抗蚜研究中最為廣泛的是植物凝集素類基因。

1.1 植物凝集素基因

植物凝集素廣泛存在于植物中，能夠特異性識別并結合糖類化合物的糖基，凝集細胞和沉淀糖蛋白［14］。按照所結合糖的特異性，植物凝集素分為7個家族——葫蘆科韌皮部凝集素家族、2-型核糖體失活蛋白家族、豆科類凝集素家族、木菠蘿（Jacalin）凝集素家族、莧菜凝集素家族、幾丁質結合凝集素家族和單子葉結合甘露糖凝集素家族［15］。植物凝集素的抗蟲可能從以下幾個方面來抑制昆蟲的生長和發育：（1）植物凝集素與昆蟲消化道內細胞表面的糖基或體內糖基化的消化酶相結合，影響昆蟲的消化吸收，或者凝集素在昆蟲的消化道內誘發病灶，導致消化道內的有害細菌大量繁殖［16］；（2）植物凝集素能夠識別并結合到昆蟲圍食膜的幾丁質上，使昆蟲消化道壁受到破壞，由此影響昆蟲的生命活動；（3）植物凝集素破壞昆蟲的神經系統，使神經信息傳遞出現絮亂，由此引發多種病變，最終導致昆蟲的死亡［17］。

1.1.1 雪花蓮凝集素（Galanthus nivalis agglutinin，GNA）基因 雪花蓮凝集素來源于石蒜科的雪花蓮，屬于結合甘露糖的單子葉凝集素家族，是同源四聚體蛋白，每個亞基上包含有3個甘露糖結合位點，對刺吸式昆蟲有很強的抑制作用，但對哺乳動物的毒性很低。1995年，Hilder等［18］首先將GNA基因轉入煙草，轉基因煙草對蚜蟲有明顯抗性，平均抑制率達到50%；徐瓊芳等［19，20］采用基因槍法將GNA基因轉入小麥品種鄭州9405中，使轉基因小麥蟲口密度平均下降68%以上；隨后將人工改造后的GNA導入小麥，T1代轉基因小麥對蚜蟲的抑制作用顯著提高，相比對照抑制率達到了90%。鐘俐等［21］、張曉英等［22］分別將GNA基因轉入甜瓜、國槐中，均獲得了具有一定抗蚜性的材料。我們將GNA基因導入棉花中，網室單株罩籠接蚜試驗結果表明，接蚜蟲10 d后，轉基因棉花材料的繁殖系數與對照（875.8倍）相比減少10倍以上，減緩蚜蟲危害使棉花卷葉程度；隨后田間調查試驗顯示，棉花移栽后15 d，對照有蚜株占到31.33%，轉基因材料3.53%-14.1%。11 d后，對照有蚜株率達到96.38%，嚴重卷葉率達到53.01%，而轉基因材料有蚜株率38.82%-80.77%，嚴重卷葉率17.64%-46.15%。這些結果說明，通過導入GNA基因可以使棉花對蚜蟲具有一定的耐性，明顯降低蚜蟲的繁殖系數，在蚜蟲爆發時與對照比較可推遲8-10 d卷葉，此時蚜蟲天敵（瓢蟲、草蛉等）開始出現，可以控制和消滅棉蚜，起到生產上不打農藥控制蚜蟲危害的效果（未發表）。

1.1.2 三 葉 半 夏 凝 集 素（Pinellia ternata Breit. Agglutinin，PTA）基因和掌葉半夏凝集素（Pinellia pedatisecta agglutinin，PPA）基因 三葉半夏和掌葉半夏塊莖的粗提物中主要含有植物凝集素蛋白PTA和PPA，其結構和作用機理與GNA相似，特異地識別并結合微生物細胞壁或昆蟲消化道表面的甘露糖殘基，對人和哺乳動物的毒性較低［23］。黃大昉等［24］用0.2%濃度的PTA飼喂蚜蟲，當處理到第5天時，蚜蟲的死亡率達到了80%-90%；Yao等［25］采用0.1%濃度的PTA飼喂桃蚜，當處理到第12天時所有蚜蟲全部死亡，說明半夏凝集素PTA具有非常好的抗蚜效果。Yu等［26］構建了cryIa和PTA的雙元表達載體，采用農桿菌介導法轉化小麥，對兩個轉基因株進行抗蚜鑒定發現，蚜蟲的存活率分別為54%和78%。吳志明等［27］克隆并將PTA基因轉化煙草，

獲得轉基因煙草對蚜蟲的平均抑制率達到77.02%；而Wu等［28］將掌葉半夏PPAb基因轉入煙草，轉基因煙草對蚜蟲平均抑制率達到了90.28%以上，并發現掌葉半夏不同部位表達不同的凝集素基因，如PPAb是一種塊莖中特異表達的凝集素基因，在其他部位基本不表達。Lin等［29］也發現了一種葉片中特異表達的PPA基因。因此，在植物不同部位表達相應不同的高活性凝集素基因，各個凝集素基因互為不同的亞型，功能互補，可能會提高抗蚜的效果。

1.1.3 尾穗莧凝集素（Amaranthus caudatus agglutinin，ACA）基因 ACA是一種來自莧菜種子的貯藏蛋白，屬莧菜凝集素家族，是同源二聚體蛋白，含有兩個糖基結合位點，能特異結合2-乙酰氨基-2-脫氧-D半乳糖［30］。ACA是一類比GNA抗蚜活性更高的凝集素。由于ACA含有多種人體必需氨基酸［30］，它除抗蚜效果外，還有助于改善作物營養品質。郭洪年等［31］將含CoYMV韌皮部特異性啟動子的ACA基因轉入煙草，轉基因煙草的蚜口抑制率高達75.3%，高于相同韌皮部特異性啟動子驅動的轉GNA基因煙草蚜口抑制率；Wu等［32］將在CoYMV韌皮部特異性啟動子驅動下的ACA基因轉入棉花，獲得的抗蚜棉對蚜蟲平均抑制率達到64.5%。

1.1.4 大蒜凝集素（Allium sativum leaf agglutinin，ASAL）基因 大蒜凝集素基因是由Dutta等［33］最先克隆到，屬于單子葉甘露糖凝集素基因家族，由兩個相同的亞基組成，能特異性地識別甘露糖。Sadeghi等［34］將韌皮部特異性啟動子驅動的ASAL基因導入煙草，轉基因煙草表現出了良好的抗蚜性，蚜口密度降低了60%，且成蚜發育遲緩；Chakraborti等［35］將ASAL基因轉入鷹嘴豆，獲得的抗蚜鷹嘴豆材料對蚜蟲致死率高達90%以上。

1.1.5 伴刀豆凝集素（Concanavalin A，Con A）基因伴刀豆凝集素最初從蓖麻中分離得到，它由4個亞基組成，能特異地結合半乳糖和甘露糖。Con A通過改變蚜蟲氨基酸的代謝過程來實現對蚜蟲的抗性［36］。將含有Con A凝集素的人工飼料飼喂蚜蟲，當Con A的濃度達到2 mg/mL時，所有蚜蟲5 d之內全部死亡，并伴隨著對蚜蟲生長、發育和繁殖的抑制作用［37］；Gatehouse等［38］將Con A基因轉入馬鈴薯，轉基因馬鈴薯能顯著抑制蟲卵的重量。

1.1.6 莧菜凝集素（Amaranth lectins，AHA） 莧菜凝集素基因克隆于莧菜種子，其廣泛存在于莧科植物中。周永剛等［39］首先克隆到AHA基因，將其轉入煙草，轉基因煙草抗蚜效率能達到90%以上，AHA基因表現出了較強的抗蚜潛力；Guo等［31］將AHA基因置于CoYMV啟動子的調控下轉入煙草，與對照相比，轉基因煙草的抗蚜效率達到了75%以上，且轉基因煙草上的蚜蟲出現了死亡現象。鄧智年等［40］將AHA基因轉入小白菜中，轉基因小白菜對桃蚜的平均抑制率為55.8%。

1.1.7 麥胚凝集素（Wheat germ agglutinin，WGA）麥胚凝集素基因，是從小麥胚芽中克隆得到的一種凝集素基因，該基因翻譯出的完整凝集素蛋白，含有兩個相同的亞基，且每個亞基上包含有兩個N-乙酰葡萄糖胺結合位點。將WGA基因轉化油菜，轉基因油菜表現出了明顯的抗蚜性，且抗蚜性能在子代群體中遺傳［41］。

1.1.8 海 芋 凝 集 素（Alocasia macrorrhiza lectin，AML） 海芋凝集素最先是由侯學文等［42］從天南星科植物海芋中分離得到。隨后，Zhu等［43］從海芋塊莖中克隆得到了AML基因，將該基因采用農桿菌侵染法轉化煙草，轉基因煙草表現出了很強的抗蚜性。潘科等［44］用AML分別處理豆蚜離體蛋白酶和淀粉酶發現，AML能顯著抑制豆蚜蛋白酶和淀粉酶活性，由此推測AML是通過抑制蚜蟲消化道內的消化酶活性來達到抗蚜目的。

1.2 其他抗蚜基因及方法

1.2.1 RNA干擾抗蚜 RNA干擾（RNAi）是指細胞內形成的雙鏈RNA（dsRNA），能夠特異性地抑制基因的表達。細胞中存在dsRNA的情況下，新的dsRNA會在dicer酶的作用下不斷形成，且由于dsRNA可在相鄰細胞間自由運輸，所以當外源dsRNA進入蚜蟲體內后，RNAi作用會在其整個生長發育期間的所有細胞內存在，從而達到抗蚜目的。利用RNAi技術培育抗蚜作物的關鍵在于選擇合適的靶基因和植物細胞中產生足夠量的dsRNA，且能通過蚜蟲的取食進入其體內而不被降解。Pitino等［45］構建了C002和Rack-1基因dsRNA載體，成功轉化煙草后能夠有效抑制目標基因的表達和抑制桃蚜的

生長發育；Mao等［46］構建了gap-geneRNAi表達載體，該載體的轉基因煙草能顯著抑制目標基因的表達，進而抑制蚜蟲的生長發育。此外，Ma等［47］克隆得到了蚜蟲異戊烯轉移酶基因，該基因控制著蚜蟲多種與生命活動相關物質的代謝，如果能通過RNAi技術，沉默掉蚜蟲異戊烯轉移酶基因，則可有效防止蚜害的發生。

1.2.2 苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL） 苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷類代謝最上游的酶類，它參與了植物多種次生代謝物的合成，如黃酮、類黃酮和花色素甙等，而這些物質均與植物的逆境耐受有關。李進步等［48］在探討棉花的抗蚜性與PAL的關系時發現，抗蚜棉花在受到蚜害脅迫時，其植物體內的PAL活性顯著高于感蚜品種，這從側面反映了PAL與植物的抗蚜關系。Han等［49］的研究也表明，蚜害能使小麥旗葉中的PAL活性顯著升高。

1.2.3 蚜蟲報警信息素（EβF） 除上述抗蚜基因及方法外，近期發現蚜蟲報警信息素的主要成分EβF會使蚜蟲停止取食，甚至從取食的植物葉片上脫落下來，并能吸引天敵的捕食和產卵［50］。Beale［51］將歐洲薄荷EβF基因轉入擬南芥，轉基因植株表現出對蚜蟲產生警戒反應并吸引蚜蟲的天敵；鄧青等［37］研究發現轉EβF合成酶基因小麥使蚜蟲凈生殖率下降，種群繁殖加倍時間延長，蚜蟲種群增長受到抑制。此外，有研究表明將煙草陰離子過氧化酶在植物中過量表達，也能增強植物對桃蚜的抗性［52］。

2 轉基因抗蚜作物存在的問題

傳統育種在抗蚜育種上起到了非常重要的作用，但由于抗蚜親本資源的匱乏，以及育種周期長、工作量大，在很大程度上制約抗蚜新品種的培育。利用轉基因技術將抗蚜基因導入作物中，使其獲得抗蚜蟲能力，已經成為作物抗蚜育種的途徑之一。目前已報道了大量抗蚜基因及其轉基因抗蚜植物，但尚未見到相關抗蚜品種在大田推廣應用。這可能是由于這些抗蚜基因轉入作物中表達量較低，導致轉基因植株抗蚜效果難以滿足實際生產需求。如Carrillo等［53］將大麥半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因轉入擬南芥，轉基因擬南芥在一定程度上抑制蚜蟲的發育，但對蚜蟲的死亡率沒有影響。Miao等［54］發現轉GNA基因小麥能夠延長蚜蟲口針對篩管的探索時間和縮短蚜蟲的取食時間，以及降低蚜蟲的繁殖率，但僅限于第1、2代蚜蟲的繁殖，從第3代開始對蚜蟲繁殖率的影響逐漸減小。另外，轉基因作物的安全性一直備受爭議。現有的大多數抗蚜基因雖然對哺乳動物沒有明顯毒性，但會直接或間接影響蚜蟲天敵的生長發育和繁殖。如研究發現轉GNA基因植物抑制蚜蟲的同時也能顯著降低蚜蟲天敵如蚜繭蜂、甘藍夜蛾赤眼蜂和菜粉蝶盤絨繭蜂的存活率［55，56］。近年來，研究發現轉基因中常采用的CaMV35S啟動子可能是一個重組熱區［57，58］，在轉基因動物細胞中檢測到了35S啟動子活性，這進一步引起了人們對轉基因安全性的思考。

3 展望

蚜蟲生長迅速，繁殖速度快，轉基因植物中外源蛋白表達量低易使蚜蟲產生抗性［59］。為提高轉基因作物的抗蚜效果，繼續挖掘更多的抗蚜基因，從中篩選出活性高、抗性強的抗蚜基因，是一條提高轉基因植物抗蚜有效途徑。另外，考慮到目前克隆的抗蚜基因主要是抑制蚜蟲的繁殖與生長發育，在今后的研究中要加強對蚜蟲具有直接毒殺作用基因的克隆，并將這兩類基因轉入同一作物，可有效防治蚜蟲抗性的形成。此外，根據不同物種對密碼子的偏好性，對現有的抗蚜基因進行改造，以及通過加入增強子等調控元件，可以使外源基因在目標作物中更好的表達，提高轉基因作物的抗蚜能力。如袁正強等［60］對GNA基因進行定點突變后獲得的轉基因植株對蚜口密度的抑制率提高到70%以上；Qin等［61］發現，煙草花葉病毒Ω序列可將原生質體中GUS基因的表達量提高3-17倍，因此煙草花葉病毒Ω序列可作為一個有效的增強子，用于提高外源基因的表達量。

除了采取以上提高轉基因作物抗蚜蟲效果的方法外，還可以根據蚜蟲的取食特點，選擇組織特異性啟動子來調控外源基因的表達，不僅會減少植物體內營養物質的浪費，還能有效降低蚜蟲抗性的形成。目前已有很多人嘗試了用韌皮部啟動子調控抗蚜基因的表達［31，32，34］，但不同的韌皮部啟動子所

介導的抗蚜效率也明顯不同。許蘭珍等［62］比較研究了GRP、Rolc和RSSI三個韌皮部啟動子的活性發現，Rolc啟動子活性最強，但在根和莖中是組成型表達，GRP啟動子活性較強且有嚴格的韌皮部組織特異性，RSSI活性最弱。對BSA韌皮部啟動子的表達分析發現其活性明顯低于35S啟動子［63］。因而，在韌皮部啟動子的選擇上要篩選特異性高、活性強的啟動子，才能有效地提高抗蚜效率。

最近，Fitches等［64］研究發現GNA在蚜蟲消化道內并不能起到直接的毒殺功能，而是起到一種運輸載體的作用，能將消化道內的其他有毒物質轉運到蚜蟲的淋巴系統中，形成對蚜蟲的毒殺作用。根據GNA的這種特性，Peumans等［65］提出了可以將有毒蛋白基因與GNA基因相融合，表達出的融合蛋白就可以借助GNA運輸進入蚜蟲體內，從而達到抗蚜目的，這為作物轉基因抗蚜提供了又一條新思路。

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（責任編輯 狄艷紅）

Progress in Aphid-resistant Genes and Transgenic Crop Research

Chen Jin1Liu Zhi1Zhu Shengwei2
（1. College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128；2. Key Laboratory of Plant Molecular Physiology，Institute of Botany，CAS，Beijing 100093）

Aphids damage, commonly and frequently occurring, caused serious losses to agricultural production. In the paper, we reviewed the progress in genetic engineering for aphid resistance, the genes resistant to aphids and their transgenic research, as well as problems existing in aphid resistance at present, and discussed employment of the methods such as cloning of direct toxin genes, site-directed mutagenesis, increasing of expressed regulation elements, lectin proteins as transport carrier to enhance aphid resistance for the aphid-resistant crops breeding program in the future.

Aphid Aphid-resistant gene Genetic engineering Transgenic crops

2014-03-14

國家“863計劃”資助項目（2012AA101108）

陳勁，男，碩士研究生，研究方向：植物基因工程；E-mail：cj314520503@163.com

朱生偉，男，副研究員，碩士生導師，研究方向：植物激素信號轉導過程和機理；E-mail：zhusw@ibcas.ac.cn