重組β-環糊精葡萄糖基轉移酶生產β-環糊精的工藝條件優化

楊玉路王蕾陳晟吳敬

（1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，無錫 214122；2.江南大學生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122）

重組β-環糊精葡萄糖基轉移酶生產β-環糊精的工藝條件優化

楊玉路1，2王蕾1，2陳晟1，2吳敬1，2

（1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，無錫 214122；2.江南大學生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122）

將來自于Bacillus circulans251的β-CGTase編碼基因克隆到表達載體pET-20b（+），轉化Escherichia coliBL21（DE3）。經酶活檢測培養基上清中的β-CGTase酶活為20 U/mL。對酶轉化淀粉生成β-環糊精的反應條件進行了優化，結果表明，當底物馬鈴薯淀粉濃度15%，反應初始pH5.5，溫度30℃，加酶量10 U/g干淀粉，環己烷濃度2.5%-5%（V/V），轉化周期24 h，β-環糊精轉化率達到最高值75.3%，是國內外報道的酶法生產β-環糊精的最高水平。

環糊精葡萄糖基轉移酶 β-環糊精 酶轉化 重組表達 淀粉

環糊精（cyclodextrin，簡稱CD），是由D-吡喃葡萄糖單元通過α-1，4糖苷鍵連接而成的環狀低聚糖的總稱，常見的環糊精由6、7和8個葡萄糖單元組成，分別稱為α-、β-和γ-CD［1-4］。由于CD分子具有內部疏水、外部親水的特性，使其能容納與其大小和形狀合適的疏水性分子或基團而形成包合物，改變這些被包埋物質的溶解度、揮發性及化學反應性能等理化性質，因而在食品［5］、醫藥、化學、農業、分析化學以及環保［6］等領域有著廣泛的應用。β-環糊精因其溶解度低，較易沉淀，在3種環糊精中最容易實現大規模的工業生產。

環糊精主要是由環糊精葡萄糖基轉移酶（cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase，EC.2.4.19）作用于淀粉、糖原、麥芽寡聚糖等葡萄糖聚合物［7-10］等底物，通過環化反應而生成。大多數情況下，CGTases進行環化反應可以同時產生α-［11］、β-［12-15］和γ-環糊精［16，17］，但通過添加不同的有機溶劑可以選擇性沉淀特定的環糊精，從而得到高純度的特定環糊精，如添加一定濃度的環己烷、甲苯、叔丁醇可以提高β-環糊精的比例和轉化率［18，19］。

本研究將來自于Bacillus circulans251［20-22］的β-CGTase基因（βcgt）連接到表達載體pET-20b（+），獲得重組質粒pET-20b（+）-βcgt，將其轉化Escherichia coliBL21（DE3）［23］并進行搖瓶發酵，測定培養基上清中的β-CGTase酶活力，旨在對酶轉化工藝進行研究，獲得高效生產β-環糊精的方法，開發β-環糊精用酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、大腸桿菌BL21（DE3）、表達載體pET-20b（+），為本實驗室保藏；大腸桿菌BL21（DE3）含pET-20b（+）空載體為對照菌種，由本實驗室構建及保藏；目的基因βcgt為上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.2 培養基 LB培養基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，氨芐青霉素0.1，pH7.0。TB培養基（g/L）：蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，K2HPO42.34，KH2PO416.43，氨芐青霉素0.1，甘氨酸7.5，pH7.0。

1.1.3 試劑 質粒小量提取試劑盒、氨芐青霉素購自上海生工生物工程公司；膠回收試劑盒、NcoI、Hind III、T4連接酶購自TaKaRa公司；α-，β-，γ-環糊精標樣購自Sigma公司；其他試劑為國產分析純。

1.1.4 主要儀器 凝膠成像儀，蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司；DYY-6C型電泳儀購自北京六一儀器廠；高效液相色譜儀購自Agilent公司；細胞破碎儀購自北京科實興業科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工程菌的構建 將攜帶目的基因βcgt的質粒pGE-βcgt經NcoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，將目的基因片段割膠回收，采用T4連接酶將目的基因和同樣酶切處理的表達載體pET-20b（+）連接，連接產物轉入E.coliJM109感受態細胞中，在平板培養基培養過夜后，挑取單克隆液體培養，然后提取質粒得到重組表達載體pET-20b-βcgt。將表達載體pET-20b-βcgt進行雙酶切驗證，驗證正確后轉入E.coliBL21（DE3）感受態細胞中，涂布LB平板培養基，挑選單克隆，培養過夜，-80℃甘油管保存。

1.2.2 搖瓶發酵生產β-CGTase 種子培養：從-80℃保存的甘油管接一定量的菌液至LB培養基，37℃、200 r/min，培養8 h。

搖瓶發酵：將種子液以5%的接種量接入TB培養基，37℃培養至OD600約為1.5時，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG同時降溫至25℃進行重組蛋白的誘導表達，轉速200 r/min，培養60 h。離心收集上清，即為β-CGTase粗酶液。

超聲破壁：用25 mmol/L，pH5.5的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液將細胞沉淀復溶到OD600為5，用細胞破碎儀進行破壁處理，離心收集破壁上清檢驗β-CGTase胞內表達情況。

1.2.3 β-CGTase環化活性測定 利用環糊精可以包埋酚酞的性質，采用比色法測定酶活［10，22，24］。用25 mmol/L，pH5.5的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液配制1%的可溶性淀粉作為底物，取2 mL底物溶液，50℃孵育10 min，加入0.1 mL適當稀釋的粗酶液，以緩沖液為空白對照，精確反應10 min，加入0.2 mL 0.6 mol/L HCl終止反應，然后加入0.5 mL 0.6 mol/L Na2CO3調pH至10.0，25℃條件下，加入0.2 mL 1.2 mmol/L酚酞溶液顯色15 min，在550 nm處測定吸光值。一個酶活單位（U）定義為在上述測定條件下1 min內生成1 μm β-環糊精所需要的酶量。

1.2.4 β-CGTase酶學性質檢測 最適溫度和溫度穩定性：采用25 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4（pH5.5）緩沖液，在30-75℃范圍內每隔5℃測定β-CGTase酶活，確定酶的最適溫度，將酶活最高的計為100%，計算各溫度下的相對酶活；在25 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4（pH5.5）緩沖液中，將酶置于上述溫度下保溫6 h，測定殘留酶活以確定酶的熱穩定性。

最適pH和pH穩定性：在50℃，pH4.0-8.0范圍內每隔0.5個pH測定β-CGTase酶活，確定酶的最適pH，以酶活最高的計為100%，計算其它pH條件下酶的相對酶活；將酶在上述pH緩沖液中于4℃放置12 h，測定殘留酶活以確定酶的pH穩定性。

1.2.5 β-環糊精的生產以及含量測定 用0.2 mol/L，pH5.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液配制15%（W/V）淀粉溶液，沸水浴中加熱糊化10 min，冷卻至反應溫度后添加一定量的β-CGTase和有機溶劑，充分混勻后在30℃、150 r/min水浴搖床中反應24 h。轉化后的液體加熱滅酶后，蒸餾除去有機溶劑，蒸餾液與95%乙醇1∶1混勻，靜置2 h，12 000 r/min離心20 min，除去未轉化的糊精，取10 μL上機分析。采用HPLC進行產物分析的色譜條件是：Agilent1200 HPLC色譜儀，Agilent自動進樣器，色譜柱250×4.6 mm 5 μm Hypersil APS-2 Column，Agilent示差檢測器；流動相為乙腈∶水（65∶35），流速0.8 mL/min；柱溫40℃。轉化率定義為生成的β-環糊精的質量比上底物的質量乘以100%。

1.2.6 β-環糊精的提取及分析 轉化之后的反應液經加熱滅酶后進行水蒸氣蒸餾，除去其中的有機溶劑，水蒸氣蒸餾液經過濾以后加熱蒸發，濃縮至飽和狀態，晶體析出，采用冷凍干燥法獲得β-環糊精的粉末，然后進行紅外光譜鑒定分析。

2 結果

2.1 高產β-CGTase重組菌的構建

2.1.1 重組質粒pET-20b-βcgt 的構建 攜帶有目的基因的質粒pGE-βcgt和本實驗室質粒pET-20b（+）分別經NcoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，將目的基因片段和pET-20b（+）膠回收、連接，轉入E.coliJM109感受態細胞，抽提質粒。重組質粒經NcoⅠ和HindⅢ雙酶切驗證，結果（圖1）顯示，在約3 700 bp和2 000 bp處有條帶，分別和載體及基因大小一致，表明重組表達載體pET-20b-βcgt構建成功。

2.1.2 重組菌E.coliBL21（DE3）/ pET-20b-βcgt的構建和培養 表達載體pET-20b-βcgt轉化進入E.coliBL21（DE3）感受態細胞中，在LB平板培養基培養，挑取單菌落接種至LB培養基培養過夜，轉接TB培養基，經0.1 mmol/L IPTG誘導表達，發酵60 h后離心取上清，得到粗酶液，經檢測，β-CGTase胞外酶活為20 U/mL，破壁上清的酶活僅為1.38 U/mL，表明90%以上的β-CGTase都分泌到胞外，而攜帶空載體的對照菌未檢測到酶活。SDS-PAGE電泳條帶（圖2）顯示，試驗菌株發酵上清液蛋白（泳道1）顯示大約在70 kD處出現一條蛋白條帶，與理論β-CGTase分子量相符，而對照菌株發酵上清液蛋白（泳道2）處無條帶，表明β-CGTase在E.coliBL21（DE3）中成功表達。

2.2 重組β-CGTase酶學性質初步研究

2.2.1 溫度對β-CGTase活性和穩定性的影響 溫度對酶活影響（圖3）顯示，重組β-CGTase的最適溫度為60℃，在50-65℃酶活可保持在85%以上，當溫度升高到70℃時，酶活下降至原來的50%。熱穩定性結果（圖4）顯示，在不同溫度下保溫6 h以后，隨著溫度升高，殘留酶活越來越低，在30℃和40℃時，殘留酶活高達90%，穩定性良好，但是高于50℃，殘留酶活降至30%以下，表明該酶對高溫的耐受性不好。

2.2.2 pH對β-CGTase活性和穩定性的影響 pH對β-CGTase活性影響結果（圖5）顯示，重組β-CGTase的最適pH值為5.5，pH在5.5-7.0之間酶活可保持在80%以上，高于7.0和低于5.5酶活都降至60%以下。pH對酶活穩定性（圖6）顯示，經過12 h保溫后，pH在5.5-7.0之間殘留酶活都保持在80%以上，表明該酶的活性在此pH范圍內穩定性良好；而在其他pH條件下，殘留酶活降至30%以下，表明該酶在過酸或過堿條件下耐受性不好。

2.3 重組β-CGTase制備β-環糊精轉化條件優化

2.3.1 反應溫度對酶轉化的影響 以15%馬鈴薯淀粉為底物，加酶量為每克干淀粉5 U，5%（V/V）環己烷，分別在30、40、50和60℃水浴搖床中轉化24 h，蒸餾除去環己烷，HPLC檢測β-環糊精生成量。如表1所示，低溫條件下，副產物比率明顯下降，轉化率也明顯上升，最高值為71.8%。這是因為低溫有利于酶的穩定及β-環糊精的特異性包埋沉淀，而高溫時酶的熱穩定性較差，反應過程中酶已失活，導致轉化率較低，所以30℃為最佳轉化溫度。以下試驗都將溫度定為30℃。

2.3.2 有機試劑及濃度對酶轉化的影響 以15%馬鈴薯淀粉為底物，加酶量為每克干淀粉5 U，分別加入2.5%、5%、7.5%和10%（V/V）環己烷、甲苯以及無水乙醇，置于30℃水浴搖床，轉化24 h，蒸餾除去有機試劑，HPLC檢測β-環糊精生成量。如表2所示，環己烷和甲苯可以顯著提高β-環糊精的比例，分別比不加有機溶劑的轉化率提高了40.4%和39.3%，并且從產物的特異性方面來看，環己烷比甲苯更有利于β-環糊精的生產；而乙醇對β-環糊精產量的提高不是很明顯，雖然總轉化率有所提升，但是特異性效果較差。對于環己烷和甲苯，加入不同的濃度對轉化率影響不大，而環己烷的毒性和沸點都低于甲苯，所以應該選擇2.5%-5%的環己烷。

2.3.3 底物種類對酶轉化的影響 分別配制15%的馬鈴薯、木薯、蠟質玉米淀粉，加酶量為每克干淀粉5 U，5%（V/V）環己烷，置于30℃水浴搖床，轉化24 h，蒸餾除去環己烷，HPLC檢測β-環糊精生成量。如表3所示，馬鈴薯淀粉作為底物時，環糊精總轉化率為71.9%，比蠟質玉米淀粉和木薯淀粉分別提高了10%和10.7%，而生產β-環糊精的特異性也稍高于另外兩種淀粉。結果表明，馬鈴薯淀粉作為底物最合適。

2.3.4 馬鈴薯淀粉濃度對酶轉化的影響 分別配制5%、10%、15%和20%馬鈴薯淀粉，加酶量為每克干淀粉5 U，5%（V/V）環己烷，置于30℃水浴搖床，轉化24 h，蒸餾除去環己烷，HPLC檢測β-環糊精生成量。如表4所示，隨著馬鈴薯淀粉濃度的增大，環糊精總轉化率雖然越來越低，但是β-環糊精在產物中所占比例越來越高。綜合考慮產品中β-環糊精比例和產率，本著節省資源，降低工業成本的原則，應選擇15%-20%濃度為宜。

2.3.5 反應時間對酶轉化的影響 以15%馬鈴薯淀粉為底物，加酶量為每克干淀粉5 U，5%（V/V）環己烷，置于30℃水浴搖床，定時取樣，檢測β-環糊精生成量。如表5所示，隨著轉化時間的延長，β-環糊精的特異性有所提高，在18 h之后轉化率提高的幅度不大，總轉化率在24 h時達最高值，為71.1%，所以可將轉化時間定為24 h。

2.3.6 反應初始pH對酶轉化的影響 分別用pH4.0-7.0的醋酸緩沖液配制15%馬鈴薯淀粉，加酶量為每克干淀粉5 U，5%（V/V）環己烷，置于30℃水浴搖床，轉化24 h，蒸餾除去環己烷，HPLC檢測β-環糊精生成量。如表6所示，當初始pH為5.5時，環糊精總轉化率最高，為72.5%。但初始pH在5.0-7.0 內對環糊精的特異性和轉化率影響不是很大，可能是因為酶在上述pH范圍內比較穩定，能夠保持較高的活性。

2.3.7 加酶量對酶轉化的影響 以15%馬鈴薯淀粉為底物，在30℃水浴條件下，加入不同量的β-CGTase，加酶量分別為每克干淀粉2.5、5.0、7.5和10.0 U，5%（V/V）環己烷，轉化24 h，蒸餾除去環己烷，HPLC檢測β-環糊精生成量。如表7所示，隨著加酶量的增多，環糊精總轉化率逐漸增大，β-環糊精的特異性也有所提高，但是在加酶量為5.0 U/g干淀粉之后，轉化率增大的不明顯，最高為10 U/g，此時總轉化率高達76.8%，而β-CD所占比例也達到最高值，為98.1%。綜合考慮特異性、轉化率及經濟性因素，可以選擇加酶量為每克干淀粉5 U。

3 討論

早在1994年，荷蘭的Catherine等［25］就克隆表達了來自于Bacillus circulans251的CGTase，并研究了此重組酶的結構，該酶顯示出了與來自于Bacillus circulans8的CGTase 75%的同源性。隨后，Ronald等［21］又對該酶的晶體結構進行了詳細的解析，Penninga等［22］則是在195位酪氨酸處做了定點突變，從而考察該位點對形成特定產物的重要作用。在上述研究的基礎上，本研究重點考察該酶的工業化應用，在E.coliBL21（DE3）中成功表達了來源于Bacillus circulans251的CGTase，酶活為20 U/mL，胞外表達量達90%以上。下一步研究重點是將該重組菌在3 L發酵罐中進行優化，獲得更高表達量的酶液。

我國對于CGTase轉化淀粉生成環糊精的研究還不是很多，王雁萍［7］以5%馬鈴薯淀粉為底物，加入10%乙醇，轉化24 h，環糊精轉化率可達57.97%。王俊英等［26］用嗜堿芽孢桿菌來源CGTase轉化5%的可溶性淀粉，β-CD的轉化率僅為40%。國外的研究相對多一些，Jemli等［27］以10%馬鈴薯淀粉作為底物，用Paenibacillus pabuliUS132來源的CGTase進行催化，環糊精總產量達42 g/L，β-CD占63%；Sian等［28］用alkalophilicBacillussp. G1來源的CGTase轉化木薯淀粉，環糊精總產量達4.25 g/L，β-CD比例高達89%；對于Bacillus circulans251來源的CGTase，Blackwood等［18］也只將β-CD的比例提高到82%。本研究在考察了溫度對酶轉化的影響的基礎上，對其他的影響條件，如有機溶劑、轉化時間、加酶量等進一步考察，最終把β-CD的轉化率提高到75.3%，而β-CD占總環糊精的比例也高達98.1%，均高于上述研究。同時，該工藝流程簡單，操作方便，這為β-CD的工業化生產奠定了堅實的基礎，具有廣闊的實際應用前景。

此外，段續果等［11］通過異淀粉酶與α-CGTase復配，將環糊精的轉化率由60.36%提高到84.63%，Rendleman等［29］嘗試不同的底物和脫支酶，環糊精的轉化率最高可達90%以上。鑒于該重組酶轉化的pH范圍比較寬，在后續的工作中考慮將脫支酶與CGTase進行復配，以此提高產物的轉化率。

4 結論

本研究成功獲得了能夠分泌表達β-CGTase的重組E.coliBL21（DE3）菌株，初步試驗表明重組菌發酵上清液中β-CGTase酶活可達20 U/mL。采用該重組β-CGTase優化了酶法生產β-CD的工藝條件。結果表明，最優條件為底物馬鈴薯淀粉濃度15%，反應pH5.5，溫度30℃，加酶量10 U/g干淀粉，環己烷濃度2.5%-5%（V/V），轉化時間24 h，β-CD總轉化率可達75.3%，且β-CD占總環糊精的比例高達98.1%。

［1］ Martin Del Valle EM. Cyclodextrins and their uses：a review［J］. Process Biochemistry, 2004, 39（9）：1033-1046.

［2］ 汪家銘.環狀糊精生產應用及市場前景［J］.武漢化工, 1998, 16（2）：3-4.

［3］ 田輝, 楊國武, 徐頤玲, 等.環狀糊精與環狀糊精葡萄糖基轉移酶［J］.工業微生物, 1995, 25（2）：33-38.

［4］ Leemhuis H, Kelly RM, Dijkhuizen L. Engineering of cyclodextrin glucanotransferases and the impact for biotechnological applications［J］. Appl Microbiol Biot, 2010, 85（4）：823-835.

［5］ Choi MJ, Ruktanonchai U, Min SG, et al. Physical characteristics of fish oil encapsulated by β-cyclodextrin using an aggregation method or polycaprolactone using an emulsion-diffusion method［J］. Food Chemistry, 2010, 119：1694-1703.

［6］ Shao D, Sheng G, Chen C, et al. Removal of polychlorinated biphenyls from aqueous solutions using β-cyclodextrin grafted multiwalled carbon nanotubes［J］. Chemosphere, 2010, 79：679-685.

［7］ 王雁萍, 談重芳, 等.應用02-5-71菌株葡萄糖基轉移酶制備β-環糊精的研究［J］.鄭州工程學院學報, 2003, 24（4）：52-55.［8］ Biwer A, Antranikian G, Heinzle E. Enzymatic production of cyclodextrins［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2002, 59：609-617.［9］ Pishtiyski I, Zhekova B. Effect of different substrates and theirpreliminary treatment on cyclodextrin production［J］. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2006, 22：109-114.

［10］ Penninga D, van der Veen BA, et al. The raw starch binding domain of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans strain 251［J］. J Biol Chem, 1996, 271（51）：32777-32784.

［11］ Duan X, Chen S, Chen J, et al. Enhancing the cyclodextrin production by synchronous utilization of isoamylase and α-CGTase［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97：3467-3474.

［12］ Sanjari S, Naderifar A, Pazuki G. Modeling and optimization of β-cyclodextrin production by Bacillus licheniformis using artificial neural network and genetic algorithm［J］. Iran J Biotech, 2013, 11（4）：223-232.

［13］ da Natividade Sch?ffer J, Klein MP, Rodrigues RC, et al. Continuous production of β-cyclodextrin from starch by highly stable cyclodextrin glycosyltransferase immobilized on chitosan［J］. Carbohydrate Polymers, 2013, 98：1311-1316.

［14］ Zhekova BY, Stanchev VS. Reaction conditions for maximal cyclodextrin production by cyclodextrin glucanotransferase fromBacillus megaterium［J］.Polish Journal of Microbiology, 2011, 2：113-118.

［15］ Muria SR, Cheirsilp B, Kitcha S, et al. Effect of substrate concentration and temperature on the kinetics and thermal stability of cyclodextrin glycosyltransferase for the production of β-cyclodextrin：Experimental results vs. mathematical model［J］. Process Biochemistry, 2011, 46：1399-1404.

［16］ Wang L, Wu D, Chen J, et al. Enhanced production of γ-cyclodextrin by optimization of reaction of γ-cyclodextrin glycosyltransferase as well as synchronous use of isoamylase［J］. Food Chemistry, 2013, 141：3072-3076.

［17］ Kelly RM, Dijkhuizen L, Lee mhuis H. The evolution of cyclodextrin glucanotransferase product specificity［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 84：119-133.

［18］ Blackwood AD, Bucke C. Addition of polar organic solvents can improve the product selectivity of cyclodextrin glycosyltransferase Solvent effects on CGTase［J］. Enzyme and Microbial Technology, 2000, 27（9）：704-708.

［19］ Lee YD, Kim HS. Effect of organic solvents on enzymatic production of cyclodextrins from unliquefied corn starch in an attrition bioreactor［J］. Biotechnology and Bioengineering, 1992, 39：977-983.

［20］ van der Veen BA, Uitdehaag JCD, van Alebeek GJ, et al. Rational design of cyclodextrin glycosyltransferase fromBacillus circulansstrain 251 to increase α-cyclodextrin production［J］. J Mol Biol, 2000, 296：1027-1038.

［21］ Knegtel RMA, Strokopytov B, Penninga D, et al. Crystallographic studies of the Interaction of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans strain 251 with natural substrates and products［J］. The Journal of Biological chemistry, 1995：29256-29264.

［22］ Penninga D, Strokopytov B, Henriette J, et al. Site-directed mutations in tyrosine 195 of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans strain 251 affect activity and product specificity［J］. Biochemistry, 1995, 34：3368-3376.

［23］ Low KO, Mahadi NM, Rahim RA, et al. An effective extracellular protein secretion by an ABC transporter system inEscherichiacoli：statistical modeling and optimization of cyclodextrin glucanotransferase secretory production［J］. J Ind Microbiol Biotechnol, 2011, 38：1587-1597.

［24］ Makela M, Korpela T, Laakso S. Colorimetric determination of β-cyclodextrin：two assay modifications based on molecular complexation of phenolphthalein［J］. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 1987, 14：85-92.

［25］ Lawson CL, van Montfort R, Strokopytov B, et al. Nucleotide sequence and X-ray structure of cyclodextrin glucanotransferase fromBacillus circulansstrain 251 in a maltose-dependent crystal form［J］. J Mol Biol, 1994, 236：590-600.

［26］ 王俊英, 關東明, 鈔亞鵬, 等.環糊精葡糖基轉移酶的酶學性質及轉化特性［J］.生物技術, 2008, 18（2）：26-28.

［27］Jemli S, Ben Messaoud E, Ayadi-Zouari D, et al. A β-cyclodextrin glycosyltransferase from a newly isolatedPaenibacillus pabuliUS132 strain：Purification, properties and potential use in breadmaking［J］. Biochemical Engineering Journal, 2007, 34：44-50.

［28］Sian HK, Said M, Hassan O, et al. Purification and characterization of cyclodextrin glucanotransferase from alkalophilic Bacillus sp. G1［J］. Process Biochemistry, 2005, 40：1101-1111.

［29］Jr Rendleman JA. Enhancement of cyclodextrin production through use of debranching enzymes［J］. Biotechnol Appl Biochem, 1997, 26：51-61.

（責任編輯 馬鑫）

Optimization of β-cyclodextrin Production by Recombinant β-cyclodextrin Glycosyltransferase

Yang Yulu1，2Wang Lei1，2Chen Sheng1，2Wu Jing1，2
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122；2. School of Biotechnology and Key Laboratory of Industrial Biotechnology Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122）

The βcgtgene encoding β-CGTase fromBacillus circulansstrain 251 was cloned into the expression vector pET-20b（+）. The vector was then transformed intoEscherichia coliBL21（DE3）for extracellular production of β-CGTase. The activity in the supernatant of recombinantE. coliBL21（DE3）was 20 U/mL. Furthermore, the condition for β-cyclodextrin（β-CD）preparation by this recombinant β-CGTase was optimized. At 15% potato starch, pH5.5, 30℃, 2.5%-5%（V/V）cyclohexane, 10 U β-CGTase per gram substrate incubated for 24 hours, 75.3% of the starch was transformed into β-CD. This is the highest level of β-CD conversion by enzyme method at home and abroad.

Cyclodextrin glycosyltransferase β-cyclodextrin Enzymatic conversion Recombinant expression Starch

2014-01-20

國家自然科學基金項目（31100048）

楊玉路，女，碩士研究生，研究方向：環糊精葡萄糖基轉移酶；E-mail：llyang08k3232@163.com

吳敬，女，博士生導師，研究方向：食品與發酵；E-mail：jingwu@jiangnan.edu.cn