食品中蠟樣芽孢污染特點及檢測方法研究進展

伊 鋆，酈 娟，董 玲，楊 永*

（武漢食品化妝品檢驗所，湖北武漢 430014）

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，B.c）自從1950年被Hauge氏首次報道其能引起食物中毒以來，就一直為學者們所廣泛關注[1]。劉秀梅等[2]的研究表明，2005年微生物造成的食源性疾病中由B.c引起的占8.9%。王洋等[3]總結了1947～2010年有文獻報道的11例B.c嘔吐型死亡案例，中國有6例，可見B.c食物中毒在我國危害性很大。

鑒于B.c污染與人們日常飲食健康息息相關，且在一定條件下會造成嚴重危害，本文綜述了幾類常見食品被B.c污染的特點，并總結了國內外學者最新研究的檢測及控制蠟樣芽孢的手段，為有針對性地監測并控制幾類食品中的污染提供參考，最大限度避免因B.c污染帶來的經濟損失以及健康損害。

1 易污染產品

1.1 糧食制品

由于我國的氣候特點為南方溫暖潮濕，北方夏秋季節室溫較高，且主食為面食或米飯，又有吃隔夜米飯等生活習慣，使B.c的污染變得不容忽視。周幗萍等[4]通過研究發現，在引發嘔吐型食物中毒的食品中，糧食加工品占非常大的比例，其中米飯及其制品約占81.1%，面制品約占10.1%，而在腹瀉型B.c食物中毒中，糧食加工品占約30%的比例。近幾年國內報道的各類糧食制品中B.c污染狀況見表1。

表1 糧食制品中蠟樣芽孢桿菌污染狀況Table 1 Contamination conditions of B.cereus in cereal products

由表1可以看出，對米面制品進行統一抽檢分析的報告結果顯示，污染率基本在4%～15%，污染率相對較低；針對米粉、米線、米飯進行專項抽檢的結果顯示污染率相對較高，這可能與抽檢樣品量及代表性有關，但報告均未能指出具體的陽性樣品污染濃度；在針對嬰幼兒輔助食品的調查中，各份調查采樣量相對充足，但檢出率相差較大。

1.2 含乳制品

乳制品在加工、運輸、儲存等環節均易受蠟樣芽孢桿菌污染，康博燕等[16]在研究酸奶生產環境中芽孢桿菌污染狀況時發現，外包裝車間存在蠟樣芽孢污染的狀況。在奶制品中的污染情況的研究較多，據報道在我國巴氏殺菌乳春季檢出率超過70%[17]，冰淇淋中達60%[18]。近幾年我國4類含乳制品中蠟樣芽孢桿菌的污染狀況見表2。

表2 含乳制品中蠟樣芽孢桿菌污染狀況Table 2 Contamination conditions of B.cereus in milk products

從表2可以看出，原料乳的污染率基本為20%～35%，檢出量較高，均已超過103CFU/mL；乳粉的污染率在7.5%～35%，四份調查結果相差較大可能與抽檢產品品牌有關，其中兩份調查報告中未能提供具體檢出量，從已知的報告中可以看出，乳粉中總體污染量維持在較低水平；對于巴氏殺菌乳及冰淇淋近年的抽查報告報出較少，單從引用報告結果看，兩種產品檢出率都很高，但污染濃度相對較低。

1.3 豆類食品

豆制品制作工藝復雜，如加工環境不衛生或在運輸和存儲過程中不注意控制溫度容易導致豆制品被蠟樣芽孢桿菌污染。在我國已經有因為豆漿[25]，豆制品（小食品）[26]被污染引起的集體中毒事件。幾類常見豆制品的污染狀況見表3。

表3 豆制品中蠟樣芽孢桿菌污染狀況Table 3 Contamination conditions of B.cereus in soybean products

由表3可以看出，發酵豆制品污染濃度相對較高。其中3份黃豆醬陽性樣本污染量達到了103CFU/g；19個腐乳樣品中有2個樣品達到106CFU/g；有16個腐乳樣品的污染量超過了103CFU/g；豆豉的調查表明雖然檢出率比較高，但陽性樣本的幾何均數檢出率均＜1 100 CFU/g。

1.4 其他類食品

除以上總結的三大類易污染產品外，國內外不斷有研究報道被蠟樣芽孢桿菌污染的其他產品。楊紅紅等[31]通過16S rDNA序列分析及構建系統發育樹確定了B.c是導致桶裝番茄醬脹袋的腐敗菌之一。楊松等[32]對錦州市3個區超市和農貿市場的新鮮海產品、海產干品、進行芽抱桿菌污染情況調查，海產干5份檢樣中有4份檢出，檢出量達到103～105CFU/g。黃結等[33]確認有12批保健食品被檢出B.c，其中螺旋藻片和鈣片檢出率分別為60.0%和21.1%。

2 檢測方法研究進展

2.1 常規培養法

常規蠟狀芽孢桿菌檢測方法主要通過特異性平板甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂選擇性分離，這種方法靈敏度高，專一性較強，但在區分蕈狀芽孢桿菌時，需要在營養瓊脂上培養數天觀察根狀生長狀況，檢驗周期較長。KIM D H等[34]研制的新型蠟樣芽孢計數培養基以馬血為基礎，加入卵黃、多粘菌素B等成分，與MYP相比，可以在樣品中背景菌較多的情況下很好地突出目標菌；盧勉飛等[35]研制的B.c顯色培養基HKMCB選擇的是具有高特異性的磷脂酶，與MYP相比可以直接從菌落顏色區分蕈狀芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌。

2.2 核酸分析方法

近年來，學者們圍繞與蠟狀芽孢桿菌致病相關的4個基因hbl、nhe、cytK和ces采用PCR法實現了對B.c毒株的快速檢驗。PCR方法在高通量檢測及鑒定致病菌方面具有明顯的優勢，表4列出了近幾年具有代表性的研究成果。其中，THAPA S P等[39]以cytK為靶基因，采用多重PCR方法，實現了同時檢測包括蠟樣芽孢桿菌在內的5中食源性致病菌的目標。CREMONESI P等[43]采用實時定量PCR方法以ces為靶基因，更實現了同時檢測包括蠟樣芽孢桿菌內的23中常見食源性致病菌。KIM J M等[37，41]則從區分致病及非致病性入手，分別采用mPCR和qPCR方法實現了蠟樣芽孢桿菌的快速檢測。ZHANG Z H等[38]將核酸交聯染料技術與多重PCR方法相結合，在滿足區分致病及非致病性蠟樣芽孢的前提下，消除了死菌DNA擴增信號對PCR擴增的影響，實現了對蠟樣芽孢活菌的檢測。MARTíNEZ-BLANCH JF等[42]利用RT-qPCR方法檢測蠟樣芽孢磷酯酰膽堿特異性磷酯酶mRNA，實現了對活菌的定量檢驗，在人工污染的樣品中檢出限可以達到1.1×104CFU/mL。

此外，為了縮短檢驗周期，周巍等[44]采用環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）檢測方法，將酸乳經前增菌后提取DNA進行分析，此方法特異性良好，以蘇云金芽孢桿菌DNA擴增也并無條帶出現，檢出限為6.4 CFU/mL，人工污染的檢出限可以達到21 CFU/mL，實現了縮短了檢測時間的目的。

表4 mPCR和qPCR方法檢測蠟樣芽孢桿菌常用引物Table 4 Common used primers for detection of B.cereus by mPCR and qPCR

2.3 現代儀器分析方法

隨著儀器制造業及信息技術的飛速發展，光譜、色譜、質譜以及各類生物傳感器都開始在微生物鑒定方面有所應用。萬佳蓉等[45]采用傅里葉變換紅外光譜非破壞性地分析B.c，結果表明，根據二階導數光譜特征吸收峰可區分B.c細胞的莢膜、芽孢、貯能物質等特殊結果物質。鄭秋月等[46]利用變性高效液相色譜分析（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）區分蠟樣芽孢桿菌不同長度DNA片段產生的特異峰形分析其gyrB基因，數百個樣本分析可以在一天完成。在FERNáNDEZ-NO I C等[47]采用微生物的鑒定領域今年發展起來的新型分析測試手段MALDI-TOF MS方法對收集到的57株芽孢桿菌進行分型，結果表明該方法可以有效區分芽孢桿菌，尤其可以很好地將B.c與解淀粉芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌區分開。KANG X B等[48]采用殼聚糖作為交聯劑制作的雙層納米金電化學免疫傳感器檢測蠟樣芽孢的檢出限可以達到10.0 CFU/mL，靈敏度在5.0×101～5.0×104CFU/mL（R=0.996 6）范圍內。喻勇新等[49]采用金屬氧化物氣敏傳感器檢測了TSB培養液中的揮發性代謝產物，可以鑒別出B.c、單增李斯特菌、緩慢葡萄球菌。

3 結語

目前國際上許多國家都已經將B.c檢測納入乳制品檢驗監測項目，但我國還沒有把蠟樣芽孢及其毒素作為一種常規監測項目來對待。盡管B.c腹瀉型食物中毒不會造成致死性傷害，但是嘔吐型食物中毒帶來的死亡事件不應該被忽視。在研究食品中蠟樣芽孢桿菌污染狀況時還存在一些問題。

首先，在監測過程中應擴大采樣量及產品類別，且監測的結果分析中應更多關注具體污染濃度，輔助毒力基因分析結果，以全面了解蠟樣芽孢的污染狀況。在避免源頭污染的同時，尤其應關注散裝的、保質期時間長的、適于低溫保存的、真空包裝產品的污染狀況。有些調查研究在4年甚至4年后才整理出版，缺乏實效性，急需構建全國范圍內的網絡平臺，及時公布調查研究結果，為以后監測方向提供參考。其次，各類新的快速檢測技術在實際樣品檢測中還存在檢出限較高的問題，且實驗人工污染樣品主要為乳制品，種類單一很難普及應用到所有食品檢驗中。開發快速、準確、高通量且能區分活菌的檢測方法仍然是今后的熱點研究方向。最后，今后在蠟樣芽孢桿菌污染的檢測方向方面是否需要監測其毒素產生狀況及監測毒力基因攜帶情況，或者監測方向是否應該監測蠟樣芽孢桿菌族在食品中污染狀況，才能更有效地避免給商家帶來經濟損失，減少給人們身體健康帶來損害，是很值得監管部門深思的問題。

[1]R E 布坎南，N E 吉本斯.伯杰細菌手冊[M].北京：人民衛生出版社，1984.

[2]劉秀梅，陳 艷，郭云昌，等.2005 年中國食源性疾病暴發事件監測資料分析[J].中國食品衛生雜志，2008，20（6）：506-509.

[3]王 洋，周幗萍.蠟樣芽孢桿菌食物中毒死亡案例分析[J].中國食品衛生雜志，2011，23（2）：191-194.

[4]周幗萍，梁天光，丁淑娟.1986～2007 年中國299 起蠟樣芽孢桿菌食物中毒案例分析[J].中國食品衛生雜志，2009，21（5）：450-453.

[5]王圓圓，方 遒，盛維立，等.銅陵地區2012 年食源性致病菌監測結果分析[J].浙江預防醫學，2014，26（8）：832-834.

[6]吳正銅，蒙俏俊，譚壯志.廣西環江縣2011～2012 年食源性致病菌監測分析[J].中國熱帶醫學，2013，13（4）：450-452.

[7]李 雪，文 濤，馬景宏，等.遼寧省2012 年食源性致病菌監測結果分析[J].中國微生態學雜志，2014，26（2）：174-177.

[8]周 虓，胡瑞林，邢麗萍，等.2011～2013 年呼和浩特市售食品蠟樣芽孢桿菌污染狀況調查分析[J].疾病監測與控制雜志，2014，8（7）：422-423.

[9]權玉玲，胡曉寧，蘭 光，等.甘肅省地方特色米面食品食源性致病菌污染調查[J].疾病預防控制通報，2013，28（3）：61-62.

[10]李秀桂，黃 彥，呂素玲，等.即食涼拌米粉及盒飯中蠟樣芽孢桿菌限量值初步探討[J].應用預防醫學，2012，18（6）：368-370.

[11]畢宇涵，鄭曉華，薛成玉，等.米面制品蠟樣芽孢桿菌污染狀況調查[J].中國公共衛生管理，2012，28（6）：819-820.

[12]費 飛.零售米飯中蠟樣芽孢桿菌污染情況調查[J].中國城鄉企業衛生，2012（152）：98-99.

[13]楊文龍，陳雅蘅，王繼金，等.嬰幼兒輔食中細菌總數及蠟樣芽孢桿菌污染情況分析[J].中國釀造，2013，32（10）：26-30.

[14]李 瑩，裴曉燕，楊大進，等.中國八省嬰幼兒食品中蠟樣芽孢桿菌污染狀況研究[J].衛生研究，2014，43（3）：435-438.

[15]宋曼丹，陳秋霞，楊 冰，等.2012 年廣東省嬰幼兒食品中3 種食源性致病菌污染狀況調查[J].華南預防醫學，2013，39（6）：17-19.

[16]康博燕，牟光慶，陳歷俊，等.酸奶生產環境中芽孢桿菌的調查與分析[J].中國奶牛，2013（11）：36-40.

[17]ZHOU G P,LIU H Z,HE J,et al.The occurrence ofBacillus cereus,B.thuringiensisandB.mycoidesinChinese pasteurized full fat milk[J].Int J Food Microbiol,2008,121(2):195-200.

[18]ZHOU G P,ZHENG D S,DOU L N,et al.Occurrence of psychrotolerantBacillus cereusgroup strains in ice creams[J].Int J Food Microbiol,2010,137(2-3):143-146.

[19]楊 媛，陳慶森，吳海清.原料乳中蠟樣芽孢桿菌部分致病基因的鑒定及毒力評價[J].食品科學，2009，30（22）：236-239.

[20]吳海清，陳慶森，龐廣昌，等.我國東北部分地區原料奶中蠟樣芽孢桿菌污染情況調查[J].西北農業學報，2009，18（3）：289-295.

[21]吳海清，陳慶森，龐廣昌，等.津晉豫魯部分地區原料奶中微生物污染情況調查[J].食品科學，2008，29（5）：373-377.

[22]宋曼丹，陳秋霞，楊 冰，等.2012 年廣東省嬰幼兒食品中3 種食源性致病菌污染狀況調查[J].華南預防醫學，2013，39（6）：17-19.

[23]姜英輝，雷質文，馬維興，等.嬰幼兒食品微生物及微生物毒素調查分析[J].檢驗檢疫學刊，2011，21（2）：5-10.

[24]黃軍林，呂志海.嬰幼兒配方奶粉中蠟樣芽孢桿菌污染的分離鑒定分析[J].現代醫藥衛生，2013，29（6）：867-868.

[25]王紅戟，陳 婭.豆漿引起學生食物中毒的實驗室分析[J].現代預防醫學，2007，34（18）：3505-3506.

[26]郭文山，董學文，楊 寧，等.一起食用豆制品所致蠟樣芽孢桿菌食物中毒[J].中國衛生檢驗雜志，2011，21（10）：2587.

[27]李志明，郭 潔，崔希勇，等.黃豆醬類食品的微生物狀況分析[J].中國調味品，2008（12）：75-76.

[28]周婷婷.蠟樣芽孢桿菌在腐乳中的污染狀況及其控制方法研究[D].廣州：華南理工大學碩士論文，2013.

[29]張金蘭，魯 緋，張偉偉，等.腐乳中蠟樣芽孢桿菌污染情況的調查分析[J].中國釀造，2010，29（10）：15-18.

[30]蔣榮榮，劉曉云，陳雅蘅，等.豆豉中蠟樣芽孢桿菌污染情況分析[J].中國釀造，2013，32（3）：67-69.

[31]楊紅紅，陳國剛，劉 婭.桶裝脹罐番茄醬中腐敗菌分離純化及鑒定研究[J].食品工業科技，2013，35（1）：164-167.

[32]楊 松，劉永華.錦州地區主要動物性食品中蠟樣芽孢桿菌污染情況的調查[J].黑龍江畜牧獸醫，2011（6）：39-40.

[33]黃 結，黃 橘.保健食品中檢出蠟樣芽孢桿菌的情況分析[J].中國食品衛生雜志，2012，24（2）：173-176.

[34]KIM D H,KIM H,CHON J W,et al.Development of blood-yolkpolymyxin B-trimethoprim agar for the enumeration ofBacillus cereusin various foods[J].Int J Food Microbiol,2013,165(2):144-147.

[35]盧勉飛，姚華卓，騰昆侖，等.蠟樣芽孢桿菌顯色培養基檢測效果初步評價[J].食品科技，2013，38（6）：313-317.

[36]ABDOU M A,AWNY N M,ABOZEID A A M,et al.Prevalence of toxicogenic bacteria in some foods and detection ofBacillus cereusandStaphylococcus aureusenterotoxin genes using multiplex PCR[J].Ann Microbiol,2012,62(2):569-580.

[37]KIM J M,FORGHANI F,KIM J B,et al.Improved multiplex PCR assay for simultaneous detection ofBacillus cereusemetic and enterotoxic strains[J].Food Sci Biotechnol,2012,21(5):1439-1444.

[38]ZHANG Z H,WANG L J,XU H Y,et al.Detection of non-emetic and emeticBacillus cereusby propidium monoazide multiplex PCR(PMAmPCR) with internal amplification control[J].Food Control,2014,35(1):401-406.

[39]THAPA S P,HAN A R,CHO J M,et al.Multiplex PCR and DNA array for the detection ofBacillus cereus,Staphylococcus aureus,Listeria monocytogenes,Escherichia coliO157:H7,andSalmonellaspp.targeting virulence-related genes[J].Ann Microbiol,2013,63(2):725-731.

[40]OLTUSZAK-WALCZAK E,WALCZAK P.PCR detection ofcytKgene in Bacillus cereus group strains isolated from food samples[J].J Microbiol Meth,2013,95(2):295-301.

[41]DZIECIOL M,FRICKER M,WAGNER M,et al.A novel diagnostic real-time PCR assay for quantification and differentiation of emetic and non-emeticBacillus cereus[J].Food Control,2013,32(1):176-185.

[42]MARTíNEZ-BLANCH J F,SáNCHEZ G,GARAY E,et al.Detection and quantification of viableBacillus cereusin food by RT-qPCR[J].Eur Food Res Technol,2011,232(6):951-955.

[43]CREMONESI P,PISANI LF,LECCHI C,et al.Development of 23 individual TaqMan real-time PCR assays for identifying common foodborne pathogens using a single set of amplification conditions[J].Food Microbiol,2014,43:35-40.

[44]周 巍，張 薇，劉 亮，等.環介導等溫擴增技術檢測酸乳中蠟樣芽孢桿菌[J].乳業科學與技術，2013，36（5）：29-31.

[45]萬佳蓉，馬美湖，周傳云，等.蠟樣芽孢桿菌的二階導數紅外光譜研究[J].光譜學與光譜分析，2007，27（5）：904-906.

[46]鄭秋月，傅俊范，孫哲平，等.變性高效液相色譜檢測食品中蠟樣芽孢桿菌[J].中國衛生檢驗雜志，2009，19（2）：255-257.

[47]FERNáNDEZ-NO I C,B?HME K,DíAZ-BAO M,et al.Characterisation and profiling ofBacillus subtilis,Bacillus cereusandBacillus licheniformisby MALDI-TOF mass fingerprinting[J].Food Microbiol,2013,33(2):235-242.

[48]KANG X B,PANG G C,CHEN Q S,et al.Fabrication ofBacillus cereuselectrochemical immunosensor based on double-layer gold nanoparticles and chitosan[J].Sensor Actuat B-Chem,2013,177:1010-1016.

[49]喻勇新，劉 源，孫曉紅，等.基于電子鼻區分三種致病菌的研究[J].傳感技術學報，2010，23（1）：10-13.