氯化銨對蘋果白蘭地揮發性香氣成分的影響

康三江，張永茂，曾朝珍，張海燕，張霽紅，張 芳

（甘肅省農業科學院 農產品貯藏加工研究所，甘肅 蘭州 730070）

蘋果白蘭地是以蘋果汁為原料經釀酒酵母發酵并蒸餾后得到的一種新型水果類白酒[1]。蘋果白蘭地的揮發性香氣物質是構成其質量的重要因素，也是評價其內在品質的重要指標，香氣的好壞直接影響著蘋果白蘭地的風味品質和消費者的選購心理[2]。ZHAO Y P等[3]對白蘭地中的芳香物質進行鑒定，結果顯示，在鑒定出來的109 種化合物中，最主要的呈香物質是酯類物質，其中2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、β-大馬酮、反式-β-甲基-γ-辛內酯是最重要的呈香化合物。彭松[4]通過對紅棗白蘭地樣品的分析得出，其揮發性物質主要為酯類、醇類、醛類、呋喃類、芳香族類、縮醛類和萜烯類。盧柯等[5]研究發現，構成荔枝白蘭地香氣特征的物質主要是酯類、醇類、酸類、少量的酚類及萜烯類化合物。

氮源是酵母生長所必需的營養物質之一，蘋果汁中含有足夠酵母生長所必需的碳水化合物，但其氮的含量較低[6]，氯化銨為酵母發酵所需的優質無機氮源物質之一。在發酵中添加適宜的氮源將會有利于酵母的生長及提高蘋果白蘭地的產量和質量。目前就關于氮源對酵母菌生長及發酵動力學研究較多，而蘋果白蘭地中氮源添加對其發酵揮發性香氣成分形成的研究報道較少。本試驗在前期優化發酵工藝的基礎上制得蘋果白蘭地，通過頂空固相微萃取（headspace solid-phase micro-extractions，HS-SPME）和氣相色譜-質譜（gas chromatohraph-mass spectrum，GC-MS）法分別測定有無氮源添加蘋果汁中發酵蘋果白蘭地酒的香氣成分，比較二者異同，揭示氮源對蘋果白蘭地發酵揮發性香氣成分的影響，對提高蘋果白蘭地酒的風味具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母1023和1620：中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC）；斜面培養基：采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基（馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然）；種子培養基：采用PDA液體培養基（裝液量100 mL/250 mL，pH自然）；富士蘋果：采自于甘肅慶陽西峰區；氯化銨（分析純）：天津奧博凱化工有限公司；焦亞硫酸鈉（分析純）：天津市恒興化學試劑制造有限公司。

1.2 儀器與設備

手動固相微萃取（SPME）進樣器，100 μm聚二甲基硅烷（polydimethylsilane，PDMS）萃取頭：美國Supelco公司；TRACE DSQ型氣相-質譜聯用儀：美國Finnigan公司；YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；B204LED型生物顯微鏡：重慶奧特光學儀器有限公司；TD50002型電子天平：余姚市金諾天平儀器有限公司；Breville-BJE500F型榨汁機：澳大利亞鉑富公司；ZHJH-C11128型超凈工作臺、2WY-2102型恒溫培養箱：上海智城分析儀器制造有限公司；RE5205型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 菌種制備

將釀酒酵母保藏菌種轉接于新鮮試管斜面，28 ℃培養48 h，4 ℃冰箱保存備用。從保存的斜面培養基中用接種環挑去6環菌苔接種于裝有100 mL液體種子培養基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min搖床培養48 h，4 ℃冰箱保存備用。

1.3.3 蘋果白蘭地酒發酵培養基的制備

在前期優化發酵工藝的基礎上向蘋果白蘭地酒發酵基礎培養基中添加250 mg/L氯化銨作為氮源并設置對照，分別裝于1 000 mL三角瓶，每瓶600 mL，重復3次。

1.3.4 蘋果白蘭地酒精發酵

將活化好的兩種釀酒酵母按照1∶1比例接種于600 mL蘋果白蘭地酒發酵培養基中，接種量為6%，接種菌含量為106CFU/mL，然后于20 ℃厭氧靜置發酵6 d。

1.3.5 測定方法

樣品處理：先將SPME萃取頭在氣相色譜的進樣口老化1 h，老化溫度250 ℃，取蘋果白蘭地酒8 mL置于15 mL鉗口瓶中，加入2 g氯化鈉，用聚四氟乙烯隔墊密封，放入電子恒溫水浴鍋中加熱30 ℃平衡10 min后，通過隔墊將已老化好的100 μm PDMS萃取纖維頭插在樣品瓶中，保持在30 ℃恒溫頂空吸附40 min后，插入GC-MS進樣口，于250 ℃解析5 min。

采用TRACEDSQ型氣相-質譜聯用儀，DB-WAX彈性石英毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）。

氣相色譜條件：程序升溫，起始溫度45 ℃，保持2.5 min，以6 ℃/min升至230 ℃，保持7 min，進樣口溫度250 ℃，傳輸線溫度230 ℃，載氣氦氣，流速1.0 mL/min，不分流進樣方式。

質譜條件：電離方式電子電離（electron ionization，EI）源，電離電壓70 eV，離子源溫度200 ℃，質量掃描范圍35～400 amu，發射電流100 μA，檢測電壓1.4 kV。

1.3.6 數據分析

數據處理采用Xcalibur軟件，利用美國國家標準與技術研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）08標準譜庫自動檢索各組分質譜數據，再結合相關文獻及標準圖譜[7]，采用色譜峰面積歸一化法計算出蘋果白蘭地酒中各化學組分相對質量百分含量。

2 結果與分析

2.1 蘋果白蘭地GC-MS總離子流色譜圖

采用頂空固相微萃取法和氣相色譜質譜聯用法對添加氮源及未添加氮源發酵蘋果白蘭地酒中的香氣成分進行檢測，得到可揮發性香氣成分的保留時間（retention time，RT）及總離子流圖，結果如圖1所示。

圖1 添加(A)和未添加(B)氯化銨發酵蘋果白蘭地中揮發性成分GC-MS總離子色譜圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of aromatic components in apple brandy with ammonium chloride (A) and without ammonium chloride (B)

2.2 不同處理發酵蘋果白蘭地香氣成分分析

采用頂空固相微萃取，通過GC-MS對未添加（CK）和添加氯化銨發酵的蘋果白蘭地中香味物質進行了分析研究，結果如表1所示。

由表1可以看出，通過GC-MS分析，添加氯化銨發酵的蘋果白蘭地經鑒定共測得48種揮發性香氣成分，其中酯類物質22種，相對含量為47.29%，醇類物質8種，相對含量為26.12%，羧酸類物質2種，相對含量為0.25%，烯烴類物質2種，相對含量為0.83%，烷烴類物質12種，相對含量為5.48%，其他香氣物質2種，相對含量為0.22%；未添加氯化銨（CK）發酵的蘋果白蘭地經鑒定共測得54種揮發性香氣成分，其中酯類物質22種，相對含量為42.55%，醇類物質8種，相對含量為31.95%，羧酸類物質4種，相對含量為0.77%，烯烴類物質4種，相對含量為1.01%，烷烴類物質12種，相對含量為5.59%，酮類物質2種，相對含量為0.09%，其他香氣物質2種，相對含量為0.11%。

表1 蘋果白蘭地香氣成分GC-MS分析結果Table 1 GC-MS analysis of aroma components in apple brandy

續表

2.3 不同處理發酵的蘋果白蘭地主體香氣成分對比分析

結合表1中蘋果白蘭地香氣成分GC-MS分析結果，對蘋果白蘭地酒中幾種主體香氣成分的作用和相對含量作了進一步分析，結果如表2所示。

表2 蘋果白蘭地中主體香氣成分相對含量Table 2 Relative content of key aroma components in apple brandy

表2結果表明，不論對照組還是添加氯化銨發酵的蘋果白蘭地中，酯類是蘋果白蘭地中含量最多的揮發性化合物，其中相對含量較高的酯類物質為乙酸乙酯、3-甲基-乙酸-1-丁酯、乙酸己酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯；揮發性酯是組成香氣化合物的最重要種類，大多數酯類具有花、果香氣，在酵母代謝產生的揮發性物質中，酯對酒的風味貢獻最大[8-9]，如辛酸乙酯略帶有玫瑰、橙子的花果香氣，是白蘭地酒特有的香味；癸酸乙酯具有葡萄的香氣[10-11]。乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和異丁醇、異戊醇被認為是構成香氣的基本成分，而其他的揮發性組分只是補充、改善和修飾上述物質所構成的基本香氣成分[12]，蘋果白蘭地的香氣基本成分辛酸乙酯、己酸乙酯和乙酸乙酯及3-甲基-1-丁醇（異戊醇）在本研究中均被檢出且相對含量較高，這與其他研究結果有相同之處。醇類是第二大類揮發性化合物，其中相對含量較高的醇類物質為3-甲基-1-丁醇、乙醇；一般醇類物質都會給人帶來刺鼻的氣味，在果酒中會給酒香帶來負效應影響，3-甲基-1-丁醇具有青草、植物香氣，這種香氣能夠持久保持，所以常在食品工業和化工行業中用于調香[13]。綜上所述，揮發性酯類和醇類物質是蘋果白蘭地揮發性香氣物質的主要種類。

從表2還可以看出，雖然對照組與添加組在主體揮發性物質成分組成上具有一致性，但這些成分在相對含量上卻存在一定的差異，添加組中總的酯類物質相對含量高于對照組，其含量分別為44.27%和38.61%；從單個酯類物質來看，除了己酸乙酯以外，添加組中主要酯類物質含量均高于對照組。

對于醇類物質而言，添加組的乙醇相對含量和對照組相比增加，而3-甲基-1-丁醇（異戊醇）的相對含量降低。異戊醇是高級醇的主要成分，但如含量過高，對人體有害，它的中毒和麻醉作用比乙醇強，能使神經系統充血，令人頭痛，并且在體內的氧化速度比乙醇慢，在機體內的停留時間長[14]。有研究發現，外加氮源對高級醇的生成有很好的抑制作用[15]，本研究結果顯示，添加外源氮可以提高蘋果白蘭地發酵酒精度和降低3-甲基-1-丁醇（異戊醇）的相對含量，這與有關報道研究結果相同，即培養基氮源不足，添加氮源可使高級醇含量降低。

3 結論

在蘋果白蘭地的揮發性物質中，酯類和醇類占的相對含量較高，構成了蘋果白蘭地的主體香氣成分。

蘋果白蘭地發酵中添加氯化銨有助于提高主要酯類物質的相對含量，降低異戊醇的相對含量，其中相對含量較高的香氣物質為乙酸乙酯、3-甲基-乙酸-1-丁酯、乙酸己酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、乙醇。

本研究只是針對無機氮源對蘋果白蘭地香氣成分影響方面做了初步研究。尚需進一步研究有機氮源、不同碳源、維生素等營養物質添加對蘋果白蘭地香氣成分的影響。

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