安梨皮渣中總黃酮微波輔助提取工藝優化

崔蕊靜，劉秀鳳，常學東*

（河北科技師范學院 食品科技學院，河北 秦皇島 066004）

安梨（Pyrus ussuriensis）俗稱酸梨，是冀東北、京、津、遼西等地燕山山脈的栽培品種之一，其營養豐富、風味獨特。現市場上安梨加工品品種較少，但目前河北省燕山地區安梨的年產量近3 000萬kg，若用來加工，約有2 000萬kg果肉可加工安梨酒、安梨醋、安梨膏、安梨茶等新型加工品，約有600～900萬kg皮渣產生，安梨皮渣大多被當作肥料、飼料甚至垃圾處理，附加值很低。安梨中黃酮類物質含量較高，具有抗氧化、降低脂質過氧化反應、預防心血管疾病、抗衰老、抗自由基和抗癌、防癌及增強免疫能力等藥理作用[1-3]。從藥用植物中提取具有生理活性的黃酮作為天然藥物、保健品和化妝品等行業的原料，已日益引起重視。因此，黃酮類化合物的提取和分離方法也將得到更加深層次的研究和開發，已有的方法將會日趨成熟和完善，各種高效、方便快捷的新方法將會不斷涌現[4]。微波處理因促進反應的高效性、強選擇性、操作簡便、副產物少、產率高及產物易提純等優點，已經被廣泛應用[5-8]。本研究采用乙醇溶液作浸提劑對安梨皮渣進行微波處理，探討微波輔助處理對安梨皮渣中黃酮類物質的浸提特性影響，旨在為安梨皮渣黃酮類物質提取工藝的產業化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

安梨皮渣：河北科技師范學院食品科技學院試驗室提供；蘆丁對照品：中國藥品生物制品鑒定所，批號100080- 200808；硝酸鋁、亞硝酸鈉、乙醇、氫氧化鈉、丙酮、甲醇等試劑均為國產分析純。

1.2 設備與儀器

723型紫外/可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司分光儀總廠；WD900B微波爐：順德市格蘭仕電器實業有限公司；JFSD-70粉碎機：上海嘉定糧油儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；DHG-9245A電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 測定方法

采用分光光度法。先用蘆丁對照品配制標準溶液，于波長510 nm處比色定量測定，制備標準曲線，然后根據樣品的吸光度計算黃酮類物質含量，再調整各種因素，求出最佳試驗條件[9-10]。

1.3.2 蘆丁標準曲線的建立[11-13]

本試驗采用亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法對提取液的黃酮含量進行測定，通過與蘆丁標準曲線的吸光度值進行對比，得到提取液內的黃酮類物質含量，計算得率。稱取蘆丁標準品10 mg，用體積分數50%的乙醇定容至50 mL容量瓶中，搖勻，得到質量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液。吸取蘆丁標準溶液0、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL分別置于10 mL比色管中，加蒸餾水4 mL，向各管加入質量分數5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻放置6 min；向各管加入質量分數10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻放置6 min；向各管加入質量分數4%的NaOH 溶液2.0 mL，搖勻，用蒸餾水定容至10 mL，放置20 min，以蒸餾水為空白對照，于波長510 nm 處測定標準蘆丁的吸光度值。

1.3.3 安梨皮渣中黃酮類物質的提取與測定

稱取樣品150 g于燒杯中，加入150 mL蒸餾水，然后放入打漿機中打漿。打漿結束后用紗布過濾得到濾液，準確量取濾液的總體積。準確量取濾液2 mL于100 mL三角瓶中，在濾液中加入一定體積分數的乙醇溶液，搖勻，微波提取，冷卻至室溫。再根據標準曲線，計算提取液中黃酮含量。

本試驗采用蘆丁含量表征試樣中總黃酮物質的含量，在測出樣品的吸光度值后，根據回歸方程計算蘆丁含量，再根據如下公式計算總黃酮得率。

式中：C為相當于標準的質量濃度，g/L；V0為測定吸光度值時所用樣液的體積，mL；V1為測定時樣液稀釋的體積；V2為樣液定容的體積，mL；M為樣品質量，g。

1.3.4 安梨皮渣中黃酮類物質提取單因素試驗

預試驗的基礎上，確定影響黃酮類物質得率的單因素試驗的基本參數為料液比、乙醇體積分數、微波功率、微波處理時間。分別變動基本參數中的單一因素，檢測相應條件下的黃酮類物質得率，考察單因素變化對黃酮類物質得率的影響。

1.3.5 安梨皮渣中黃酮類物質提取正交試驗設計

以料液比、微波處理時間、微波功率、乙醇體積分數作為安梨總黃酮得率的考察因素，在單因素試驗的基礎上，以安梨總黃酮得率為指標，按表1采用L9（34）正交試驗設計對安梨總黃酮提取工藝進行優化，每個水平3 次重復，取平均值。

表1 黃酮物質提取條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for flavonoid extraction conditions optimization

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線制作

以蘆丁標準液質量濃度為x軸、吸光度值為y軸，繪制標準曲線如圖1，并得到回歸方程，所得回歸方程為y=11.369x+0.009 2，其線性范圍為0～0.1 mg，相關系數0.999 3。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 安梨皮渣總黃酮提取的單因素試驗

2.2.1 料液比對總黃酮得率的影響

量取安梨皮渣濾液6份，每份2 mL，分別置于100 mL三角瓶中，按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（mL∶mL）的比例混合體積分數50%乙醇提取劑，在微波功率為360 W條件下浸提3 min，按照“1.3.3”的方法測定各提取液吸光度值，計算不同料液比中總黃酮得率。

圖2 不同料液比對總黃酮得率的影響Fig.2 Effects of different solid to liquid ratio on total flavonoid yield

由圖2可以看出，安梨皮渣中總黃酮得率隨料液比中乙醇的增加逐漸提高，在料液比為1∶10（mL∶mL）時得率達到最大值，主要的原因是提取劑比例的提高，增加了料液體系與提取劑體系間有效成分的濃度差，也減少了物料內部有效成分的殘留量，從而提高得率；再增加料液比時，總黃酮得率反而下降。究其原因，可能是提取劑對微波能的吸收增加，導致細胞液對微波能吸收減少，細胞破裂不完全，安梨總黃酮不能被充分溶出。同時增加提取劑比例會增加溶劑的用量，也會加大后續處理工序的投入成本。對不同處理的總黃酮得率進行方差分析，F=15.75＞F0.01（5，12）=5.06，說明料液比對總黃酮得率存在極顯著差異。因此料液比不超過1∶10（mL∶mL）為宜。

2.2.2 微波處理時間對總黃酮得率的影響

安梨皮渣濾液中，按1∶10（mL∶mL）的比例加入體積分數50%乙醇提取劑，在微波功率為360 W條件下分別浸提2 min、3 min、4 min、5 min、6 min，其余條件同“2.2.1”。

圖3 不同提取時間對總黃酮得率的影響Fig.3 Effects of different extraction time on total flavonoid yield

由圖3可以看出，微波處理時間＜3 min時，總黃酮得率不斷增加，處理時間＞3 min后總黃酮含量反而下降。這可能是由于微波短時間處理對物料細胞膜的破壞作用較小，總黃酮浸出量少，隨著時間延長，微波對植物細胞強烈的破壁作用及加快萃取組分的分子由物料內部擴散到萃取溶劑界面的速度，所以總黃酮浸出量增多，但隨時間繼續延長，細胞膜進一步破裂，當總黃酮溶解度達飽和時，有效成分不再被溶出，且物料中粘液質及其他雜質被溶出，使浸出液黏度增大，從而擴散速度變慢，后續工序過濾變得困難，且隨時間增加，可能使黃酮類化合物被破壞。對不同處理的總黃酮得率進行方差分析，F=32.41＞F0.01（4，10）=5.99，說明微波處理時間對總黃酮得率存在極顯著差異。綜合各考慮，確定微波處理時間為3 min。

2.2.3 微波功率對總黃酮得率的影響

安梨皮渣濾液中，按1∶10（mL∶mL）的比例加入體積分數乙醇提取劑，在不同的微波功率180 W、360 W、540 W、720 W、900 W條件下浸提3 min，其余條件同“2.2.1”。

從圖4可以看出，隨著微波功率的增加總黃酮得率也增加，當超過一定功率時，總黃酮含量降低。這可能是因為當微波功率較低時，微波對細胞膜的破壞作用較小，分子運動不劇烈，故總黃酮浸出量較低；隨著微波功率不斷增加，微波對細胞的破壁作用和加熱作用，加速了細胞內有效成分的快速溶出，總黃酮浸出量隨之增加；但當微波功率過大時，使乙醇暴沸蒸發較多，造成提取液不能很好的與物料接觸，提取劑不能有效的進入細胞，且黃酮類化合物熱穩定性差，在較高功率條件下結構被破壞，雜質溶出也較多，使黃酮浸出率降低。對不同處理的總黃酮得率進行方差分析，F=22.67＞F0.01=5.06，說明微波功率對總黃酮得率存在極顯著差異。綜合考慮浸提效果和成本，確定微波功率為360 W。

圖4 不同微波功率對總黃酮得率的影響Fig.4 Effects of different microwave power on total flavonoid yield

2.2.4 乙醇體積分數對總黃酮得率的影響

安梨皮渣濾液中，按1∶10的比例分別加入不同體積分數（0、15%、30%、50%、70%、90%）的乙醇溶液作提取劑，在微波功率為360 W條件下浸提3 min，其余條件同“2.2.1”。

圖5 不同乙醇體積分數對總黃酮得率的影響Fig.5 Effects of different ethanol concentration on total flavonoid yield

由圖5可以看出，隨著乙醇體積分數的增加，總黃酮得率也隨之升高，在乙醇體積分數為50%時達到最大值；繼續增加乙醇體積分數，安梨總黃酮得率反而下降，這可能與微波加熱的機理有關，提高乙醇體積分數可以增加提取劑對物料的滲透性，并可提高黃酮類化合物的溶解度，從而提高安梨總黃酮的得率。但在使用微波加熱時，物料中的極性分子尤其是水分子吸收微波能，因為水的介電常數比乙醇大，更易吸收微波，產生大量熱量而使物料升溫，乙醇體積分數增加減小了料液中水的比例，使物料升溫減慢，從而影響得率。另外，乙醇體積分數過高會使細胞內的蛋白質凝固，而葉綠素等脂溶性物質的溶出量增多，從而導致黃酮類化合物的浸出率下降[14-15]。對不同處理的總黃酮得率進行方差分析，F=14.32＞F0.01=5.06，說明乙醇體積分數對總黃酮得率存在極顯著差異。綜合考慮，乙醇體積分數為50%為宜。

2.3 微波提取安梨皮渣總黃酮工藝的優化

單因素試驗基礎上，對影響安梨皮渣黃酮類物質得率的主要因素料液比、提取時間、微波功率、乙醇體積分數進行L9（34）正交試驗，結果見表2，方差分析見表3。

表2 黃酮物質提取條件正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for flavonoid extraction conditions optimization

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test results

對表2中的結果進行極差分析可知，各因素對安梨總黃酮得率影響的主次順序為C＞A＞D＞B，即微波功率對得率影響最大，料液比和乙醇體積分數次之，而微波提取時間影響較小。最佳提取工藝條件為A1B2C2D2，即料液比1∶10（mL∶mL），提取時間3 min，微波功率360 W，乙醇體積分數50%，總黃酮得率最高達0.210%。由表3可知，四因素的F均大于F0.01，說明各因素對安梨皮渣總黃酮得率均存在極顯著的影響。

3 結論

微波輔助提取安梨皮渣總黃酮的適宜工藝條件是料液比1∶10（mL∶mL），微波處理時間3 min，微波功率360 W，乙醇體積分數50%，總黃酮類得率最高達0.210%。本試驗優化了安梨皮渣黃酮類物質的提取工藝，提高黃酮類物質的得率。

試驗中采用的安梨皮渣是濕品，故造成黃酮類物質得率低，若采用經烘干的安梨皮渣干品，會使工藝延長，耗能加大。

微波輔助提取安梨皮渣黃酮類物質，與傳統浸提法相比較，微波法的提取時間較短，速度快，節約能源，是一種比較理想的提取安梨總黃酮的方法。

[1]孫智敏，李發堂，殷 蓉，等.黃酮類化合物提取工藝研究進展[J].河北化工，2005（4）：4-6.

[2]魯曉翔，唐津忠.紫背天葵中總黃酮的提取及抗氧化性研究[J].食品科學，2007，28（4）：145-148.

[3]梁 丹，張保東.黃酮類化合物提取和分離方法研究進展[J].周口師范學院學報，2007，24（5）：87-89，97.

[4]劉世民.微波法提取芹菜中黃酮類物質的探討[J].食品研究與開發，2004，25（3）：48-50.

[5]曾 里，劉世貴.微波技術應用于銀杏黃酮浸提的研究[J].四川大學學報，2004，41（4）：833-836.

[6]李巧玲.黃酮類化合物提取分離工藝的研究進展[J].山西食品工業，2003（4）：6-7.

[7]崔蕊靜，申淑琦，郭 朔.復合酶協同微波處理提取紫背天葵葉片總黃酮工藝[J].中國食品學報，2014，14（2）：72-77.

[8]劉志成，楊民生，申湘忠.微波輔助法提取艾葉總黃酮的研究[J].湖南人文科技學院學報，2008（2）：12-15.

[9]葉 春，闞建全，譚書明，等.微波輔助提取魚腥草葉總黃酮的工藝研究[J].中國釀造，2009，28（1）：134-137.

[10]劉素果，任 琪，溫媛媛，等.石榴果皮總黃酮的提取工藝[J].經濟林研究，2010，28（3）：62-68.

[11]雪 峰，岳永德.黃酮類化合物的提取·分離純化和含量測定方法的研究進展[J].安徽農業科學，2007，35（26）：8083-8086.

[12]張 巖，曹國杰，張 燕，等.黃酮類化合物的提取以及檢測方法的研究進展[J].食品研究與開發，2008，29（1）：154-158.

[13]陳 偉，劉青梅.微波技術在杜仲黃酮提取工藝中的應用研究[J].食品科學，2006，27（10）：285-294.

[14]周文斌.葛根中總異黃酮的微波輔助萃取研究[J].食品科學，2004，25（2）：100-106.

[15]仇 燕.菜芙蓉花中總黃酮微波提取的研究[J].中藥材，2006，29（4）：387-389.