以發芽大豆為原料固態發酵產富含納豆激酶食品工藝優化

黃 勛，王常蘇，高澤鑫，高 冰*

（1.武漢生物工程學院 生物科學與技術系，湖北 武漢 430415；2.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；3.湖北工業大學 輕工學部，湖北 武漢 430068）

血栓是由纖維蛋白原和血小板聚集形成的[1]，常引發腦梗塞、心肌梗塞和中風等疾病，是一種嚴重危害人類健康的心血管疾病[2]。納豆激酶屬于納豆枯草芽孢桿菌絲氨酸蛋白酶，體內體外實驗都已證明具有高效的溶栓活性[3-4]，其不僅可以直接溶解交聯狀的血栓，而且可以催化血纖維蛋白原轉化成有活性的血纖維蛋白原溶酶，增加體內血栓溶解因子的合成，增強體內血栓的溶解活性[5]。目前，納豆激酶主要被用作功能食品使用，作為潛在藥品的應用正在研發中。與臨床常用的溶栓藥物相比，納豆激酶作為功能食品食用具有安全性好、生產成本低、無毒副作用、半衰期長、易口服等諸多優點。因此，納豆激酶相關產品是纖溶酶產業化開發中最為熱門的產品。

以大豆為原料發酵制備的納豆激酶產品，因存在著不愉快的氣味和口感，限制其在國內的推廣。大豆因營養價值豐富而被譽為“來自田野的肉制品”。以大豆為主要原料的豆制品近年來備受廣大消費者的青睞，其中豆芽是人們喜歡的食物之一[6]。大豆經過適當的發芽后，降低了大豆中的抗營養因子（如植酸、脹氣因子、脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制劑），提高了大豆的營養價值，并能形成獨特的風味和口感，近年來，用豆芽加工的產品的相繼問世[7]。大豆在發芽過程中脂肪、總糖含量降低，滿足了人們對于低脂肪、低糖、高蛋白大豆的需求[8-11]，尤其是大豆發芽過程中一些功能性因子的生物合成和積累引起了人們關注，如大豆經適當的發芽，提高了大豆中異黃酮的含量[12-13]以及γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，γ-GABA）的積累量。大豆異黃酮具有抗氧化，預防骨質疏松，預防心血管疾病以及抗癌等豐富的功能[14-20]。GABA是一種非蛋白氨基酸，廣泛分布于動物和植物體內，并具有多種人體的生理功能，是哺乳動物的神經系統的主要抑制性遞質。目前市售的GABA保健品藥物，多數是經化學合成得到，對身體是有一定的副作用且價格昂貴。GABA具有多功能的生理保健作用，對于其應用到深度產品的研發中是十分有價值的[21-26]。

因此選用發芽大豆為原料制備富含納豆激酶的食品，不僅改善了產品的口感，而且豐富了產品的功能性，為納豆激酶相關食品的開發提供了理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus natto）BN-05：由本實驗室保存。

1.1.2 培養基

LB培養基：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl，15 g/L瓊脂，pH 7.0。液體種子培養基：10 g/L葡糖糖，5 g/L酵母提取物，10 g/L牛肉膏，5 g/L NaCl，pH 7.4～7.6。

1.1.3 主要試劑

纖維蛋白原標準試劑（88 mg可凝蛋白/支）、牛凝血酶（560 U/支）、尿激酶生物標準品（1 240 IU/瓶）：中國藥品生物制品檢定所；瓊脂糖：法國Biowest公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D超凈工作臺：廣州瑞智科學儀器有限公司；WFJ2100紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；LHS-250SC 型智能型恒溫恒濕培養箱：上海浦東榮豐科學儀器有限公司；SLY-2112B立式雙層大容量恒溫培養搖床：金壇市盛藍儀器制造有限公司；5424R冷凍離心機：德國Eppendorf公司；SPS2001F感量2 000 g天平：奧豪斯公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發芽大豆的制備

首先進行人工精選，再用蒸餾水沖洗，加入蒸餾水在室溫條件下浸種，放大鏡觀察大豆的種子生長狀況，并依據GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》對發芽大豆中γ-氨基丁酸的含量進行檢測分析[27]。

1.3.2 固態發酵工藝

將精選的發芽大豆進行清洗除雜，加入5倍質量的清水，20～25 ℃浸泡6～8 h，瀝去水分，115 ℃滅菌30 min，待其冷卻至35 ℃以下，接種發酵培養，于37 ℃靜置恒溫培養，每隔12 h攪拌一次。發酵結束后，提取粗酶液，用瓊脂糖-纖維蛋白原平板法測定納豆激酶（nattokinase，NK）酶活。

1.3.3 固態發酵工藝試驗設計

（1）Plackett-Burman法篩選影響發酵的主要因素

通過單因素試驗確定了影響固態發酵產納豆激酶的參數為發芽大豆的蒸煮時間、基質含水量、裝樣量、發酵溫度、葡萄糖添加量、發酵時間、接種量以及Mg2+的添加量。選用試驗次數N=12的Plackett-Burman設計安排，對這八個因素進行研究，分別記作A、B、D、E、G、H、K、L，每個參數分別取2個水平，另外設置3個虛擬項C、F、J，用于對試驗誤差進行估計，各因素水平取值見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman test

（2）響應面試驗設計

在對Plackett-Burman試驗結果充分分析的基礎上，在最陡坡試驗確定的區域內，采用中心組合設計（central composite design，CCD)響應面設計方法，以納豆激酶酶活為響應值對顯著因素進行優化，各因素水平和編碼見表2。

表2 CCD試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of CCD test

1.3.4 功能成分分析及產品營養分析

功能成分分析：納豆激酶活性的測定采用瓊脂糖-纖維蛋白原法進行測定[28]。γ-GABA含量的測定依據國標GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》。

產品營養成分分析：發酵發芽大豆的營養成分檢測委托武漢市產品質量監督檢驗所和湖北省農業科學院質量標準與檢驗技術研究所共同完成，檢測方法參考SB/T 10528—2009《納豆》、GB/T 5009.124—2003、GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》。

2 結果與分析

2.1 發芽大豆的制備工藝

（1）精選大豆，去除無胚粒、未成熟顆粒及雜質，用自來水沖洗三遍，洗去表面的灰塵；

（2）用0.05%NaClO溶液浸泡20～30 min，再用純凈水沖洗3～5 min去除表面的NaClO，瀝干水分；

（3）加入純凈水在20～25 ℃條件下浸泡6～8 h；

（4）浸泡完成后，瀝干水分，將大豆均勻地攤在底部有小孔的經過消毒的培養籃中中，蓋上已消毒的紗布，在紗布上面噴灑適量的純凈水，移入23 ℃的恒溫培養箱中，每隔2 h噴灑適量的純凈水以保持大豆的濕度，每隔8 h用純凈水沖洗大豆以免被霉菌污染，整個發芽過程，濕度控制在80%～95%，發芽時間為26～30 h，芽長1～2 mm。

（5）依據國家標準GB/T 5009.124—2003對發芽大豆進行檢測分析，γ-氨基丁酸的含量達到233.56 mg/100 g干基。

2.2 Plackett-Burman 試驗結果及分析

Plackett-Burman具體試驗設計及結果見表3。

表3 發酵條件優化Plackett-Burman試驗結果Table 3 Results of Plackett-Burman experiment for fermentation conditions optimization

表4 發酵條件優化Plackett-Burman 試驗因素方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiment for fermentation conditions optimization

由表4可知，發酵溫度（E）、接種量（K）、Mg2+（L）對固態發酵產酶有顯著的影響，因此最終篩選的主效應參數為E、K、L，接種量的增加、Mg2+及發酵溫度的降低，納豆激酶的活力呈先升后降的趨勢，且在不同的處理時間都存在著顯著性差（P＜0.05），因此后續試驗選擇E、K、L這三個因素進行中心點的設計。

2.3 響應面中心組合設計結果及分析

2.3.1 中心組合設計結果及回歸模型分析

根據Plackett-Burman試驗確定的主效應參數，通過Design-expert 8.0軟件設計響應面中心組合試驗，CCD的試驗設計結果見表5，回歸方程方差分析見表6。

表5 發酵條件優化CCD試驗結果Table 5 Design and results of CCD experiment for fermentation conditions optimization

最小乘法擬合二次多項式，試驗因子和響應面的關系可用以下方程表示：

由表6可知，模型本身（P＜0.000 1）非常顯著，且模型失擬項0.229 4＞1.902 296，差異不顯著，故模型選擇合適，有實際應用意義。回歸模型的R2=94.04%，表明相關性顯著，失擬項不顯著，表明多項式對試驗擬合情況較好，試驗誤差小。決定系數R2adj=0.886 909，說明該模型能解釋94.05%響應值的變化決定系數反映了方程對數據擬合的程度，因此響應值的94.05%可以通過該二次回歸方程來解釋，說明擬合的模型較合適。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of the regression model

根據上述的回歸方程及回歸模型方差分析表，繪制各因素交互作用響應面和等高線圖，結果見圖1。

圖1 發酵溫度、接種量、Mg2+含量對納豆激酶酶活交互影響的響應面和等高線Fig.1 Response surface plots and contour line showing the effect of interactions of fermentation temperature,inoculum,Mg 2+concentration on NK activity

由圖1可看出，當發酵溫度、接種量與Mg2+添加量三個變量中的某一個因素固定于中心水平時，其他兩個因素共同作用對試驗結果的影響呈拋物面型關系，變化趨勢都是先增大后減小，且響應面均存在一個極大值點。接種量與Mg2+添加量的交互效應對納豆激酶活力影響較顯著，其結果和表6描述的一致。

此回歸模型得出CCD試驗的最優培養條件為培養溫度35.16 ℃，接種量7.17%，Mg2+的添加量0.20%，納豆激酶的活力6 987.67 IU/g。

2.3.2 驗證試驗

為方便實際操作，將回歸模型中得到的最佳工藝參數定為培養溫度為35 ℃，接種量為7%，Mg2+的添加量為0.20%，按此條件進行3次平行試驗，發酵完成后，測定納豆激酶的活力為6 918.76 IU/g，結果表明納豆激酶的活力與預測值相差不大，說明該方程與實際值擬合情況很好，結果見表7。

表7 響應面分析的驗證試驗Table 7 Verification test of the response surface analysis

在優化單因素和響應面條件，選擇大豆及發芽大豆進行對照，由表8可知，發芽大豆為發酵底物優于大豆。

表8 發酵底物對照試驗Table 8 Control test of fermentation substrate

3 結論

相比大豆而言，發芽大豆不僅降低了抗營養因子，富集了豐富的γ-氨基丁酸（γ-GABA），而且發芽大豆的營養成分滿足了人們對于低糖、低脂肪、高蛋白大豆的需要，所以選用發芽大豆作作為原料更符合現代食品發展的理念，以此作為發酵底物優化產納豆激酶的發酵條件。

通過單因素預試驗確定影響產NK酶活的因素，采用Plackett-Burman法篩選出影響發酵的主要因素為發酵溫度、接種量和Mg2+的添加量，再通過中心組合設計方法，建立了產酶回歸模型，確定了該模型最佳取值時各參數水平：蒸煮時間15 min、基質含水量55%、裝樣量30 g/250 mL、發酵溫度35 ℃、接種量7%、發酵時間36 h、Mg2+添加量0.20%，其中接種量與Mg2+添加量的交互效應對產酶活力影響最顯著。再次通過驗證性試驗，證明了在響應面優化條件下，納豆激酶的活力為6 918.76 IU/g，比以大豆為原料提高了58.35%。

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