藍靛果藍莓復合果酒抗氧化能力的研究

薛桂新

（延邊大學農學院 食品科學系，吉林 延吉 133002）

發酵果酒作為一種健康酒類，開發的種類逐漸增多。隨著研究的進行，人們逐漸認識到單一品種的果酒在色、香、味及營養成分和保健價值方面存在一定的不足和缺陷。復合發酵果酒綜合了各種果汁的優勢和特點，營養更加豐富，保健價值也更加合理，釀出的果酒色香味俱佳、風格獨特[1]。近年來復合型果酒的研究成為熱點，如黑莓山楂復合發酵果酒、金櫻子火棘復合果酒、椰子水腰果梨復合果酒、草莓金櫻子復合果酒[2-5]，柑橘梨汁復合酒、芒果木瓜復合酒、山楂葡萄復合酒、雪蓮果西番蓮復合酒、櫻桃番茄復合酒、藍莓葡萄復合酒和桑葚五味子復合發酵酒等[6-12]，但大都是加工工藝及生產技術等方面的研究。而集營養保健于一身的藍靛果藍莓復合果酒及其抗氧化能力的研究卻很少，除了楊占江[13]專利外，其他少見報道。

本實驗對不同藍莓添加量的藍靛果藍莓復合果酒進行了研制，然后以自制的藍靛果藍莓復合果酒為研究對象，比較研究了復合果酒在陳釀期間抗氧化能力的高低及其變化趨勢，為藍靛果藍莓復合果酒的開發利用提供理論依據，也為藍靛果藍莓復合果酒最佳飲用期的確定提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍靛果由延邊林業科學研究院種植基地提供，藍莓采自吉林省安圖縣藍莓種植基地。六氰合鐵酸鉀、三氯乙酸、硫酸亞鐵、抗壞血酸、鄰苯三酚和苯酚、三氯化鐵、三羥基氨基甲烷、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：國藥集團化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）：北京Solarbio公司；以上藥品均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1102分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；BSA124S-CW電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司；PHS-3C型數字酸度計：上海鵬順科學儀器有限公司；FJ-2000型高速分散均質機：上海標本模型廠；DW-86L828超低溫冰箱：青島海爾集團。

1.3 實驗方法

1.3.1 藍靛果藍莓復合果酒的研制

藍靛果、藍莓采收后放在低溫冰箱中凍結貯存。實驗時將凍結的果實解凍后分選、破碎、果漿調整成分、發酵、過濾、后發酵、陳釀后，得到藍靛果藍莓復合果酒。

本實驗以不添加藍莓為對照，采用3種不同處理，每個處理藍靛果和藍莓總量為5 kg，每個處理藍靛果和藍莓復合比例不同，其中處理1、處理2、處理3藍莓添加量分別為10%、30%、50%。

1.3.2 藍靛果藍莓復合果酒指標測定方法

酒精度：GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精計法；可溶性固形物：手持糖度計法；總酸：酸堿滴定法；總糖：采用苯酚硫酸法[14]；多酚：福林試劑法[15]。

1.3.3 藍靛果藍莓復合果酒抗氧化能力的實驗方法

藍靛果藍莓復合果酒抗氧化作用選擇了對DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基和還原力的測定四個指標進行研究。

（1）藍靛果藍莓復合果酒清除DPPH·的實驗方法

稱取0.012 8 g DPPH，用無水乙醇溶解于50 mL容量瓶，定容，搖勻，作為儲備液保存于冰箱中，使用時用無水乙醇稀釋10倍。吸取10 mL DPPH儲備液，用無水乙醇定容于100 mL容量瓶中搖勻，30 min后在517 nm波長處測定吸光度值，按下列公式計算DPPH自由基清除率：

式中：SA為DPPH自由基的清除率，%；Ac為空白試劑的吸光度值；As為樣品的吸光度值。

（2）藍莓復合果酒清除超氧陰離子（O2-·）的實驗方法

采用鄰苯三酚自氧化法。取4.5 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，加4.2 mL蒸餾水混勻后在25 ℃恒溫水浴中保溫20 min后，取出立即加入在25 ℃預熱過的3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL（以l0 mmol/L HCl配制，空白用10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚HCl溶液），迅速搖勻后倒入比色杯，每隔0.5 min在320 nm處測定溶液的吸光度，計算線性范圍內每分鐘吸光度的增加值。

取4.5 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCI緩沖液，加入3.3 mL蒸餾水混勻后在25 ℃恒溫水浴中保溫20 min后，取出立即加入復合果酒0.9 mL，再加入在25 ℃預熱過的3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL，迅速搖勻后倒入比色杯，每隔0.5 min在320 nm處測定溶液的吸光度值，計算線性范圍內每分鐘吸光度的增加值。

式中：△A0為一定時間內對照吸光度值的變化；△A為一定時間內樣品吸光度值的變化。

（3）藍靛果藍莓復合果酒清除羥自由基（·OH）的實驗方法

本實驗采用水楊酸比色法。利用H2O2與Fe2+反應產生羥自由基，在體系內加入水楊酸捕捉并產生有色物質，該物質在510 nm下有最大吸收。反應體系中依次加入10 mmol/L FeSO41 mL，10 mmol/L水楊酸-乙醇1 mL，復合果酒1 mL，最后加8.8 mmol/L H2O21 mL啟動反應，在37 ℃條件下反應0.5 h，以蒸餾水為對照，測定吸光度值?？紤]復合果酒本身的顏色，以10 mmol/L FeSO41 mL，10 mmol/L水楊酸-乙醇1 mL，復合果酒1 mL，1 mL蒸餾水作為復合果酒的本底值。

式中：A0為對照的吸光度值；A1為樣品反應體系的吸光度值；A2為復合果酒本底值的吸光度值。

1.3.4 藍靛果藍莓復合果酒還原力的實驗方法

取復合果酒2.5 mL，加入25 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=6.6）和2.5 mL 1%六氰合鐵酸鉀溶液[K3Fe（CN）6]，于50 ℃水浴保溫20 min后快速冷卻，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），離心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸餾水，0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，充分混勻，靜置10 min后，在700 nm處測定其吸光度值（以蒸餾水為對照），吸光度值的大小代表復合果酒還原力的高低。

2 結果與分析

2.1 藍靛果藍莓復合果酒的理化指標

表1 藍靛果藍莓復合果酒的理化指標Table 1 Physicochemical indexes of Lonicera edulis and blueberries compound wine

由表1可知，四種復合果酒中可溶性固形物、總糖和總酸含量差異很??；酒精度和多酚存在一定的差異，對照均高于處理。三個處理相比，酒精度處理1＞處理2和處理3，多酚含量處理1＞處理2＞處理3，即隨著復合酒中藍莓添加量的增多，多酚含量隨之減少，這是因為藍莓多酚含量顯著低于藍靛果（P＜0.01）[16]，所以藍莓添加量越多，多酚含量就越少。

2.2 藍靛果藍莓復合果酒清除DPPH·能力的比較

由圖1可知，藍靛果藍莓復合果酒中，藍莓的添加量不同清除DPPH自由基的能力也不同。處理1和處理2清除DPPH自由基的能力好于對照（P＜0.05），處理3與對照相當，這表明藍靛果藍莓復合果酒具有清除DPPH自由基的能力，并且隨著藍莓添加量增多，清除DPPH自由基的能力反而減小，這是因為藍莓中多酚、黃酮和花色苷含量顯著低于藍靛果（P＜0.01）[16]，這些成分具有較強的清除自由基能力和抗氧化活性[17]，所以藍莓添加量增多，抗氧化活性成分減少，清除DPPH自由基的能力也隨著降低。本實驗中藍莓添加量為10%的處理清除DPPH自由基的能力最強。從曲線的趨勢看，隨著陳釀時間的延長清除DPPH自由基的能力逐漸降低，陳釀5個月后藍莓添加量為10%、30%、50%和對照清除DPPH自由基的能力分別降低了42.17%、48.66%、50.67%和51.53%。

圖1 不同藍莓添加量對復合酒DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of blueberry addition on scavenging activity of DPPH free radical of compound wine

2.3 藍靛果藍莓復合果酒清除超氧陰離子（O2-·）能力的比較

圖2 不同藍莓添加量對復合酒超氧陰離子清除率的影響Fig.2 Effect of blueberry addition on scavenging activity of superoxide anion of compound wine

由圖2可知，藍靛果藍莓復合果酒中藍莓的添加量不同清除超氧陰離子的能力也不同，處理1＞處理2＞處理3，處理1和處理2清除超氧陰離子的能力明顯好于對照（P＜0.05），而處理3清除超氧陰離子的能力低于對照，這可能是因為藍靛果藍莓復合果酒的抗氧化能力不僅與總多酚、總黃酮和總原花青素等含量水平相關，還與其各自組分的含量相關，并且它們之間存在著增效或拮抗作用[18]。處理3藍莓添加量為50%，在這個含量水平總多酚、總黃酮和總原花青素及其各自組分可能存在拮抗作用，所以其抗氧化能力低于對照，而處理1和處理2藍莓添加量分別為10%和30%，在這個含量水平總多酚、總黃酮和總原花青素及其各自組分可能存在增效作用，所以其抗氧化能力高于對照。本實驗中藍莓添加量為10%的處理清除超氧陰離子的能力最強。從曲線的趨勢看，隨著陳釀時間的延長清除超氧陰離子的能力逐漸降低。陳釀5個月后藍莓添加量為10%、30%、50%和對照清除超氧陰離子的能力分別降低了49.05%、59.43%、59.19%和58.62%。

2.4 藍靛果藍莓復合果酒清除羥自由基（·OH）能力的比較

圖3 不同藍莓添加量對復合酒羥自由基清除率的影響Fig.3 Effect of blueberry addition on scavenging activity of hydroxyl radical of compound wine

由圖3可知，藍靛果藍莓復合果酒中藍莓的添加量不同清除羥自由基的能力也不同。處理1＞處理2＞處理3，處理1、處理2清除羥自由基的能力明顯強于對照（P＜0.05），而處理3清除羥自由基的能力低于對照，這一結果與圖2清除超氧陰離子的結果一致，其原因也是因為藍靛果藍莓復合果酒的抗氧化能力與總多酚、總黃酮和總原花青素等含量、各自組分的含量以及它們之間存在著增效或拮抗作用有關。本實驗中藍莓添加量為10%的清除羥自由基的能力遠遠高于其他處理。從曲線的趨勢看，隨著陳釀時間的延長，藍靛果藍莓復合果酒清除羥自由基的能力逐漸降低。陳釀5個月后藍莓添加量為10%、30%、50%和對照清除羥自由基的能力分別降低了47.63%、62.29%、83.50%和71.07%。

2.5 藍靛果藍莓復合果酒還原力的比較

圖4 不同藍莓添加量對復合酒還原力的影響Fig.4 Effect of blueberry addition on reducing power of compound wine

由圖4可知，處理1的OD值明顯大于對照（P＜0.05），處理2的OD值與對照幾乎一致，處理3的OD值比對照低。以OD值的高低來衡量各個處理的還原力的大小，處理1還原力最好，處理2與對照基本一致，處理3低于對照。從曲線的趨勢看，隨著陳釀時間的延長，藍靛果藍莓復合果酒的還原力逐漸降低，可能是因為藍靛果藍莓復合果酒在陳釀期間存在著一定量的溶解氧，這些溶解氧與總多酚、總黃酮、總原花青素等活性成分發生反應，降低了活性物質的含量，也可能使活性成分的結構發生變化，導致抗氧化能力降低；而且藍靛果藍莓復合果酒是一種復雜的混合體系，陳釀期間發生多種生理生化變化和酶促反應，這些反應可能影響活性成分的抗氧化機理，也會導致抗氧化能力降低。陳釀5個月后藍莓添加量為10%、30%、50%和對照的還原力分別降低了40.02%、41.29%、52.94%和38.70%。

3 結論

本實驗選擇的DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子及鐵離子還原力是目前常用于評價天然抗氧化成分體外抗氧化活性高低的四種方法[19]。藍靛果藍莓復合果酒中藍莓添加量不同表現出的抗氧化能力也不同，藍莓添加量為10%和30%的復合果酒，其DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子的清除率均高于對照，而鐵離子還原力則不同，只有添加10%藍莓的復合酒明顯高于對照。由此可見，由于各種評價方法的機理有所差異，同一物質在不同評價體系里可能表現出不同的抗氧化活性[20]。所以采用多種方法綜合評價藍靛果藍莓復合果酒的抗氧化能力是很有必要的。

藍莓添加量為10%的復合果酒其抗氧化能力最高，隨著陳釀時間的延長，藍靛果藍莓復合果酒清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子的能力和鐵離子還原力均很快下降，陳釀5個月后其抗氧化能力下降幅度可達40%以上。

不論是藍靛果藍莓復合果酒還是單一藍靛果果酒，隨著陳釀時間的延長，四種抗氧化評價指標均很快下降，尤其清除羥自由基的能力下降的幅度更大。從果酒風味的角度看，酒是陳的香，但從抗氧化的角度評價，果酒釀造后應盡快適量飲用更有利于身體健康。所以，從風味和保健兩方面評價果酒比單從風味或保健一個方面評價果酒更科學更全面。

[1]吳 翔，高 亮，羅澤章.復合發酵果酒的研制[J].釀酒科技，2003（6）：75-76.

[2]杜云建，朱孔岳，付 瑾.黑莓山楂復合發酵果酒的研究[J].中國釀造，2009，28（12）：149-151.

[3]杜 琨.金櫻子火棘復合果酒研制[J].中國釀造，2010，29（8）：164-166.

[4]袁 璐，劉四新，陳文學.椰子水腰果梨復合果酒的研制[J].中國釀造，2011，30（11）：186-189.

[5]江明珠，顏 輝，聞 燕，等.草莓金櫻子復合果酒的發酵工藝研究[J].中國釀造，2011，30（12）：189-192.

[6]熊海燕，陳興勉，康 玲，等.柑橘梨汁復合酒的初步發酵工藝研究[J].江蘇農業科學，2010（5）：414-416.

[7]盧璽羽.芒果和木瓜復合發酵果酒的研制[D].長春：吉林農業大學碩士論文，2012.

[8]潘中田，蒙艷紅.山楂葡萄果酒釀造技術研究[J].賀州學院學報，2013，29（3）：132-134.

[9]潘嫣麗，農志榮.雪蓮果-西番蓮混合果酒發酵工藝的研究[J].安徽農業科學，2011，39（9）：5367-5369.

[10]肖春玲，李桂峰，尉豐嬋，等.櫻桃番茄果酒加工工藝技術的研究[J].中國農學通報，2011，27（2）：420-423.

[11]蘇俊峰，程建軍，劉宏杰.正交法優化藍莓-葡萄復合果酒[J].北方園藝，2010（6）：188-191.

[12]龐少華.桑葚五味子復合發酵酒工藝研究[D].煙臺：煙臺大學碩士論文，2013.

[13]楊占江.一種開胃型藍莓藍靛果復合果酒及其制備方法，中國：201110314535[P].2012.

[14]王岸娜.福林法測定獼猴桃多酚含量的研究[J].食品科學，2008，29（7）：398-401.

[15]孫璐宏.柿果醋生產過程中抗氧化性能的變化研究[D].楊凌：西北農業科技大學碩士論文，2011.

[16]樊梓鸞，王振宇，程翠林，等.5 種野生漿果的抗氧化和抗細胞增殖活性[J].食品科學，2010，31（17）：147-152.

[17]朱海芳.幾種藥食兩用中草藥抗氧化作用的功能評價[D].泰安：山東農業大學碩士論文，2009.

[18]張 昂.葡萄冬剪枝條抗氧化特性及活性酚類成分的研究[D].楊凌：西北農業科技大學博士論文，2013.

[19]張桂芝，耿 莎，楊海燕，等.植物抗氧化成分的研究進展[J].食品科學，2007，28（12）：551-55.

[20]成喜雨，崔 馨，劉春朝，等.中草藥抗氧化活性研究進展[J].天然產物研究與開發，2006（18）：514-518.