薏米納豆發酵工藝及其營養成分分析

董岳峰，麻秀芳，李曉艷，張 璐，李小進，郭曉鶯

（1.山西省醫藥與生命科學研究院，山西 太原 030006；2.武警山西總隊醫院，山西 太原 030006）

納豆（natto）[1]是一種日本豆類發酵食品，是以黃豆為主要原料，蒸煮之后接入納豆芽孢桿菌發酵而成，富含鈣、磷、鈉、鉀及各種維生素，營養價值極高，對骨質疏松、心腦血管病和腫瘤等均有一定的預防作用[2]。納豆含有一種發酵食品特殊的氨味，不易被國人所接受[3]。本實驗通過在發酵底物配方中增加含糖量較高的輔料薏米，提高碳氮比來降低游離氨的生成，改善納豆口感[4]。薏米是藥食皆佳的雜糧之一，富含蛋白質、碳水化合物、8種氨基酸、亞油酸、維生素、各種微量元素以及薏醇、甾醇等[5]。薏米的糖質含量比大豆高，在大豆中加入一定量的薏米后，使糖質總量增加，提高納豆發酵配方中的碳氮比，改善納豆口感，并對薏米納豆的營養成分進行綜合分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆、薏米：購于山西省美特好連鎖超市；凝血酶、尿激酶標準品：中國藥品生物制品檢定所；纖維蛋白原、考馬斯亮藍G-250：美國Sigma公司；納豆芽孢桿菌：本實驗室保存。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS全自動高壓滅菌鍋：上海博迅實業有限公司；HZ-9211K恒溫振蕩器：太倉市科教器材廠；SHP-80生化培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；HH-501數顯恒溫水浴鍋：常州國華儀器制造有限公司；CJ-1S超凈工作臺：天津泰斯特儀器有限公司；835-50型氨基酸分析儀：日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 納豆菌生長曲線測定[6]

取液體培養的納豆芽孢桿菌，用牛肉膏蛋白胨液體培養基調整納豆芽孢桿菌濃度為1.0×108個/mL，用無菌移液管準確量取10 mL接種于裝有90 mL牛肉膏蛋白胨液體培養基的250 mL三角瓶中，置于37 ℃搖床，150 r/min培養，每4 h取樣，平板菌落計數法計數，以培養時間為橫坐標，菌體濃度為縱坐標，繪制生長曲線。

1.3.2 尿激酶標準曲線測定

納豆激酶的纖溶酶活性是通過與尿激酶的活力比較，得到的相當于尿激酶的活力單位。酶活力測定參照Astrup法[7]。

1.3.3 納豆激酶活力測定

稱取新鮮薏米納豆5 g加入100 mL無菌去離子水中，充分振蕩，紗布過濾。取濾液10 μL 點樣于纖維蛋白平板，放置10 min，37 ℃保溫18 h，考馬斯亮藍G-250[8]染色5 min，測定溶圈直徑，根據標準曲線計算薏米納豆激酶活力。

1.3.4 薏米納豆發酵工藝路線

精選黃豆，室溫條件下浸泡4 h，瀝干備用；薏米室溫條件下浸泡2 h，100 ℃糊化15 min，瀝干，薏米黃豆按質量比1∶4混合均勻，121 ℃滅菌20 min，冷卻至60 ℃左右時接種液體納豆菌（菌體濃度1.0×108CFU/mL），37 ℃培養24 h，4 ℃后熟24 h。

1.3.5 單因素試驗

選取薏米黃豆質量比2∶8，接種量5%，發酵時間為24 h為基數，分別改變三個因素（薏米黃豆質量比、接種量、發酵時間）中的一個，進行單因素試驗。其中薏米黃豆質量比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5；接種量為3%、4%、5%、6%、7%；發酵時間為12 h、18 h、24 h、30 h、36 h。按照1.3.4的步驟進行操作，每組試驗3個平行（n=3），分別進行感官評價，并測定納豆菌總數和納豆激酶酶活。

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1.3.6 薏米納豆發酵工藝正交優化

在單因素試驗的基礎上，以薏米與黃豆質量比、接種量和發酵時間為主要因素，以感官評價分值、納豆菌總數和納豆激酶酶活性及三者的加權評分為評價指標，采用L9（34）正交表選取不同水平進行正交優化。感官評價采用雙盲法打分，以表1評分標準進行打分[9]。

綜合評分=（感官評價分值/感官評價最大分值）×100×0.4+（納豆菌總數/納豆菌總數最大值）×100×0.3+（納豆激酶活力/納豆激酶活力最大值）×100×0.3。

表1 薏米納豆感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of coixseed-natto

1.3.7 相關指標測定

氨基酸成分測定：參考GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定方法》[10]；氨基酸態氮測定：采用甲醛滴定法[11]；總黃酮和多糖含量測定：參照《保健食品功效成分檢測方法》，總黃酮測定采用分光光度法，多糖含量測定采用硫酸蒽酮法[12]；薏米納豆水分測定參照GB/T 5009.3—2010《食品中水分的測定》采用干燥法測定[13]；總砷測定參照GB/T 5009.11—2003《食品中總砷及無機砷的測定》[14]；鉛測定參照GB/T 5009.12—2010《食品中鉛的測定》[15]；黃曲霉素B1參照GB/T 5009.22—2003《食品中黃曲霉毒素B1的測定》檢測[16]；糞大腸菌群參照GB 4789.39—2013《食品微生物學檢驗-糞大腸菌群計數》[17]檢測，致病菌（沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌）參照GB 4789.31—2013《食品微生物學檢驗-沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌的腸桿菌科噬菌體診斷檢驗》進行檢驗[18]。

1.3.8 氨基酸態氮測定

采用甲醛滴定法[11]。

參照《保健食品功效成分檢測方法》，總黃酮測定采用分光光度法，多糖含量測定采用硫酸-蒽酮法[12]。

1.3.10 薏米納豆理化指標和衛生學指標檢測

薏米納豆水分測定參照GB/T 5009.3—2010《食品中水分的測定》中干燥法測定[13]；總砷測定參照GB/T 5009.11—2003《食品中總砷及無機砷的測定》[14]；鉛測定參照GB/T 5009.12—2010《食品中鉛的測定》[15]；黃曲霉素B1參照GB/T 5009.22—2003《食品中黃曲霉毒素B1的測定》檢測[16]；糞大腸菌群參照GB 4789.39—2013《食品微生物學檢驗-糞大腸菌群計數》[17]檢測；致病菌（沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌）參照GB 4789.31—2013《食品微生物學檢驗-沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌的腸桿菌科噬菌體診斷檢驗》進行檢驗[18]。

2 結果與分析

2.1 納豆菌生長曲線測定結果

圖1 納豆芽孢桿菌生長曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus natto

液體培養的納豆芽孢桿菌生長曲線見圖1。由圖1可知，在0～8 h內，納豆芽孢桿菌生長速度較慢，處于延滯期；從8 h開始納豆芽孢桿菌生長迅速，進入對數生長期；從20 h開始納豆芽孢桿菌生長變緩，納豆芽孢桿菌數趨于穩定，進入穩定期；從36 h開始納豆芽孢桿菌數量開始減少，進入衰亡期。因此，作為固體培養的種子液選用培養16 h的納豆芽孢桿菌。

2.2 尿激酶標準曲線測定結果

尿激酶活力標準曲線見圖2，回歸方程為y=0.039 1x+0.066 1，R2=0.999 5。

圖2 尿激酶活力標準曲線Fig.2 Standard curve of urokinase activity

2.3 單因素試驗結果

單因素試驗結果見表2～表4。薏米黃豆質量比，接種量和發酵時間對薏米納豆的感官評價、納豆菌總數和納豆激酶酶活力都有影響，各因素比較適宜的范圍為薏米黃豆質量比為1∶9～3∶7，接種量為4%～6%，發酵時間為18～30 h。

表2 薏米黃豆質量比對試驗結果的影響Table 2 Effect of coixseed and soybean ratio on coixseed-natto quality

表3 接種量對試驗結果的影響Table 3 Effect of inoculum on coixseed-natto quality

表4 發酵時間對試驗結果的影響Table 4 Effect of fermentation time on coixseed-natto quality

2.4 薏米納豆發酵工藝正交優化結果與分析

由表5直觀分析可知，薏米/黃豆質量比、接種量、發酵時間3個因素對綜合評分的影響順序為薏米/黃豆質量比＞接種量＞發酵時間，最優組合為A2B2C2。即薏米納豆的最佳發酵工藝為薏米黃豆質量比2∶8，接種量5%，發酵時間為24 h。采用此工藝進行驗證性試驗（n=3），薏米納豆的感官評價分值為96.78±0.45，納豆菌總數（4.11±0.22）×108CFU/g，納豆激酶活力（1 423±35）IU/g。由表6方差分析可知，薏米/黃豆質量比對綜合評分的影響具有顯著性（P＜0.05），接種量和發酵時間對試驗結果影響無顯著性（P＞0.05）。

表5 薏米納豆發酵工藝正交試驗設計及結果Table 5 Design and result of orthogonal experiment for fermentation technology optimization

表6 正交試驗結果方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.5 薏米納豆氨基酸分析結果

薏米納豆中氨基酸種類豐富，結果見表7。其中，8種必需氨基酸中除色氨酸外均被檢測到，亮氨酸含量最高，為1.16%，賴氨酸和蘇氨酸含量較低，均為0.62%，必需氨基酸總量為4.81%。非必需氨基酸中谷氨酸含量最高，為3.31%，其次為天冬氨酸，胱氨酸含量最低，為0.27%，非必需氨基酸總量為9.43%，薏米納豆中的氨基酸總量為14.24%。

表7 薏米納豆的氨基酸組成Table 7 Amino acids compositions of coixseed-natto

2.6 薏米納豆總黃酮、多糖和氨基酸態氮分析

黃酮類化合物具有較強的抗氧化活性，可有效清除體內自由基，阻止細胞的退化、衰老以及癌癥的發生[19]，薏米納豆總黃酮含量為0.043%。多糖類化合物能發揮免疫調節作用，具有抗病毒和抗腫瘤活性[20]，薏米納豆多糖含量為3.3%。氨基酸態氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量，含量越高營養越好，薏米納豆的含量為0.4%。

2.7 薏米納豆理化指標和衛生學指標檢測

表8 薏米納豆理化指標和衛生學指標檢測結果Table 8 Physicochemical properties and microbial index of coixseed-natto

3 結論

薏米納豆的最佳發酵工藝為薏米黃豆質量比2∶8，接種量5%，發酵時間為24 h。薏米納豆氨基酸含量為14.24%，種類豐富，富含黃酮、多糖、氨基酸態氮等活性成分，理化指標及衛生指標滿足國家相關標準。產品氣味芳香，黏液較多，氨基酸成分豐富，感官品質良好，口感良好，適合我國人民的飲食習慣。薏米的糖質含量比大豆高，在納豆菌發酵納豆的過程中，薏米的糖質與大豆中較高的蛋白質轉化為納豆中碳水化合物，從而減少納豆游離氨的形成改善納豆口感。此外，薏米納豆的開發為大豆和薏米的深加工及附加值的提高開辟了新途徑，對我國納豆產業的發展及國民健康發揮重要作用。

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