通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)法優(yōu)化白僵菌發(fā)酵培養(yǎng)基研究初報(bào)

摘 要 運(yùn)用通用旋轉(zhuǎn)方法設(shè)計(jì)方案，以秸稈等添加料為培養(yǎng)基基質(zhì)，以產(chǎn)孢量為指標(biāo)，尋找成本低、效率高、實(shí)用性強(qiáng)的分生孢子粉生產(chǎn)配方。結(jié)果表明：（1）麥麩19.5 g，碎米23.0 g，秸稈粉29.5 g，豆粉15.0 g是白僵菌Bb-021發(fā)酵最適合培養(yǎng)基配比；（2）在25℃，濕度90%～100%條件下培養(yǎng)5 d產(chǎn)孢量達(dá)到9.24×1013個(gè)/mL孢子。

關(guān)鍵詞 白僵菌；發(fā)酵；培養(yǎng)基；通用旋轉(zhuǎn)

中圖分類(lèi)號(hào)：S482.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-890X（2014）13-020-03

知網(wǎng)出版網(wǎng)址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20140704.2038.022.html 網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-7-4 20：38：00

白僵菌（Beauveria bassiana）屬于半知菌綱鏈孢霉目鏈孢霉科，是一種真菌性殺蟲(chóng)劑，其孢子接觸害蟲(chóng)后產(chǎn)生芽管，通過(guò)皮膚侵入其體內(nèi)長(zhǎng)成菌絲，并不斷繁殖使害蟲(chóng)新陳代謝紊亂致死。白僵菌的致病力強(qiáng)，防治害蟲(chóng)效果好，持效期較長(zhǎng)，對(duì)高等動(dòng)物和植物無(wú)害。白僵菌的使用有利于減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，避免環(huán)境污染，使防治成本降低；容易獲得；對(duì)天敵無(wú)害，維護(hù)了生態(tài)平衡；防治的害蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗藥性[1-3]。

目前對(duì)白僵菌的發(fā)酵有液體發(fā)酵法，固體發(fā)酵法和液固雙相發(fā)酵法。液固兩相培養(yǎng)法由于生產(chǎn)效率高、經(jīng)濟(jì)實(shí)用而被廣泛采用[4-5]。因此，本文選用液固雙相發(fā)酵二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，控制配料的種類(lèi)和添加數(shù)量，在保證白僵菌功能性質(zhì)不受影響的前提下，建立了以產(chǎn)孢量為目標(biāo)函數(shù)的函數(shù)模型，并研究固體培養(yǎng)基配料秸稈粉、麥麩、碎米、豆粉和水之間的關(guān)系，從中篩選出最佳的培養(yǎng)料配合比例，為優(yōu)化發(fā)酵工藝和增加白僵菌產(chǎn)孢量提供一定的理論支持。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌種

白僵菌Bb-021，菌株為實(shí)驗(yàn)室分離菌種。

1.1.2液相培養(yǎng)基

PDB培養(yǎng)液（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL）。

1.1.3固相培養(yǎng)基

4種載體，即麥麩、碎米、秸稈粉、豆粉。接種培養(yǎng)后，計(jì)算各組合的產(chǎn)孢量。

1.2方法

1.2.1通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)

以影響白僵菌發(fā)酵的麥麩（X1）、碎米（X2）、秸稈粉（X3）、豆粉（X4）為 4個(gè)試驗(yàn)因子，以白僵菌的產(chǎn)孢量（Y）為目標(biāo)，4因素（1/2實(shí)施）的二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，共計(jì)20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，用以確定白僵菌發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)工藝組合。確定零水平及變化區(qū)間如下：秸稈粉以30 g為零水平；麥麩、碎米以20 g為零水平；豆粉以15 g為零水平，共設(shè)置0、±1、±1.6818五種水平。

1.2.2發(fā)酵工藝

白僵菌孢子粉1.0 g→加0.05%Tween-80的無(wú)菌水20 mL→研磨器研磨至無(wú)菌塊→渦旋儀震蕩20 min→血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)（用0.05%Tween-80和白僵菌孢子粉將孢子懸液調(diào)節(jié)到1×108孢子/mL）→取1 mL菌懸液加入到含100 mLPDB發(fā)酵液的發(fā)酵瓶中→（25±1）℃恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)3 d，振蕩頻率為200 r/min→在超凈臺(tái)中，用滅菌薄棉花過(guò)濾去除菌絲→取2 mL過(guò)濾菌液分別加入不同組合發(fā)酵瓶中，滅菌玻璃棒攪拌均勻→25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)→5 d后，超凈臺(tái)下攪拌均勻，每瓶各取1 g（濕重），0.05%Tween-80無(wú)菌水100 mL洗脫孢子→血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)產(chǎn)孢量。

1.2.3產(chǎn)孢量的計(jì)算

用血球計(jì)數(shù)板依次對(duì)懸浮液中的白僵菌孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，按對(duì)角線法取5個(gè)大格為1個(gè)計(jì)數(shù)單位，每個(gè)濃度的孢子懸浮液取5個(gè)計(jì)數(shù)單位的平均值。

1.2.4統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法。

2結(jié)果與分析

2.1白僵菌發(fā)酵最適培養(yǎng)基

利用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方案，其實(shí)驗(yàn)組合及結(jié)果見(jiàn)表1。按照20個(gè)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出所擬合的回歸方程的各項(xiàng)系數(shù)，并根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（表1）可知，失擬性檢驗(yàn)差異不顯著，可認(rèn)為所選用的二次回歸模型是適當(dāng)?shù)模豢梢赃M(jìn)一步分析，剔出α=0.10的不顯著項(xiàng)后，建立產(chǎn)孢率對(duì)試驗(yàn)因子的回歸方程為：Y=25.00349+11.09911X2+8.67611X32-7.79250X1X2。生長(zhǎng)量函數(shù)因不可能考慮到全部因素，因而求解不一定得到實(shí)際上最優(yōu)化的條件。如果將該模型在電腦上擬合試驗(yàn)，采用頻率次數(shù)分析法便可尋找最優(yōu)工藝。對(duì)數(shù)學(xué)回歸模型進(jìn)行頻率分析得到的結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)表2可以看出，在95%的置信區(qū)間內(nèi)產(chǎn)孢量大于3.743×1012的優(yōu)化方案為麥麩19.03～20.41 g，碎米22.85～24.05 g，秸稈粉29.16～30.84 g，豆粉14.30～15.71 g。從處理中選出的優(yōu)化培養(yǎng)方案的變量值不局限于旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)里20個(gè)給定的因子水平之內(nèi)，試驗(yàn)優(yōu)化方案的產(chǎn)孢量為9.24×1013個(gè)/mL（xi：-1.6820，1.6820，-1.6820，-1.6820），由此可知實(shí)際測(cè)定值與理論值比較接近。為便于實(shí)際生產(chǎn)，將優(yōu)化方案定為麥麩19.5 g，碎米23.0 g，秸稈粉29.5 g，豆粉15.0 g。

2.2數(shù)學(xué)模型的應(yīng)用分析

選取秸稈粉、豆粉2個(gè)因素固定于零水平，作圖分析麥麩、碎米2個(gè)因子間的互作效應(yīng)（圖1）。從圖中可以看出在麥麩一定時(shí)，隨著碎米量的增加白僵菌的產(chǎn)孢量呈逐漸上升趨勢(shì)；當(dāng)碎米含量較低時(shí)，隨著麥麩量的增加產(chǎn)孢量也有所增加；當(dāng)碎米含量較高時(shí)，產(chǎn)孢量隨麥麩的增加反而減少。這可能是因?yàn)樗槊咨贂r(shí)麥麩提供主要營(yíng)養(yǎng)，當(dāng)碎米增加時(shí)，碎米取代麥麩提供主要營(yíng)養(yǎng)，并且碎米間空隙較多使培養(yǎng)基通氣量增加，從而更加利于白僵菌的發(fā)酵。

由圖2可以看出碎米和秸稈粉的互作效應(yīng)。在秸稈粉一定時(shí)，碎米與產(chǎn)孢量成正比；在碎米一定時(shí)，產(chǎn)孢量隨著秸稈粉的增加先降低后升高。這可能是由于秸稈粉大量時(shí)提供足夠的營(yíng)養(yǎng)，少量時(shí)增加發(fā)酵罐疏松程度，從而獲得高產(chǎn)孢量。

3討論

本實(shí)驗(yàn)采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，降低成本，避免了資源消耗，提高了結(jié)果的精確度。在多因素的系統(tǒng)中，每個(gè)因素間都存在著互作、互制的復(fù)雜關(guān)系。任何一個(gè)因素的微小改變都可能給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)巨大的影響。在發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中就遇到過(guò)此類(lèi)問(wèn)題，為了減少試驗(yàn)誤差，提高產(chǎn)孢量、減少成本及優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的目標(biāo)，參考許多文章的基礎(chǔ)上，采用4個(gè)因素（麥麩、碎米、秸稈粉、豆粉）作為發(fā)酵培養(yǎng)基，通過(guò)二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，取得了一定的效果。本研究的試驗(yàn)結(jié)果與單因素試驗(yàn)所得到的結(jié)論略有差異，主要因?yàn)檠芯恳蛩刂杏袃蓚€(gè)因素對(duì)產(chǎn)孢量影響較為顯著，另外兩個(gè)不顯著，這還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

參考文獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：敬廷桃）