五味子乙素對乳鼠缺氧/復氧損傷心肌細胞的保護作用及其機制

劉 威,張成義,沈 楠,金 宏,袁 瑞,萬曉明,齊 玲

(1.吉林醫藥學院實驗中心,吉林吉林 132013;2.北華大學藥學院藥理學教研室,吉林吉林132001; 3.吉林醫藥學院病理學教研室,吉林吉林 132013)

五味子乙素對乳鼠缺氧/復氧損傷心肌細胞的保護作用及其機制

劉 威1,張成義2,沈 楠1,金 宏1,袁 瑞1,萬曉明1,齊 玲3

(1.吉林醫藥學院實驗中心,吉林吉林 132013;2.北華大學藥學院藥理學教研室,吉林吉林132001; 3.吉林醫藥學院病理學教研室,吉林吉林 132013)

目的:探討五味子乙素(Sch B)預處理對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧(H/R)損傷的影響,并探討其可能機制。方法:分離培養原代乳鼠心肌細胞,將其分為對照組、模型組和10、50、250 mg·L－1Sch B預處理組,除對照組外各組細胞采用2 mmol·L－1Na2S2O4培養2 h后換用正常培養液培養18 h,造成心肌細胞H/R損傷。倒置顯微鏡觀察各組心肌細胞形態學變化,MTT法檢測各組細胞存活率,檢測各組細胞中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)水平。結果:與對照組比較,模型組細胞明顯回縮、停搏或浮起,細胞存活率明顯降低(P＜0.01),LDH和CK活性及MDA水平升高(P＜0.01),SOD活性降低(P＜0.01);與模型組比較,SchB預處理各組細胞博動尚存,回縮較輕,細胞存活率明顯升高(P＜0.01), LDH和CK活性及MDA水平降低(P＜0.01),SOD活性升高(P＜0.05或P＜0.01)。結論:Sch B對乳鼠H/R損傷的心肌細胞具有保護作用,其機制可能與其抗脂質過氧化作用有關。

五味子乙素;心肌細胞;缺氧/復氧損傷;抗氧化

心肌缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)損傷是指H/R心肌在恢復血運后原損傷反而加重,一般發生于再灌注后24 h內。H/R損傷常導致心律失常、心肌舒縮功能障礙、代謝異常以及心肌超微結構改變[1]。隨著血管再通技術的迅速開展,心肌H/R損傷成為影響療效和阻礙治療的最主要原因,如何減輕H/R損傷成為醫學界新的挑戰[2]。有文獻[3-6]報道:五味子各成分具有抗心肌H/R損傷作用,但具體作用機制尚不清楚。本研究采用耗氧劑連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)制備原代培養心肌細胞H/R損傷模型,檢測其乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)水平,探討五味子乙素(schizandrin B,Sch B)對H/R損傷心肌細胞的保護作用及其可能機制,為新藥開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器出生72 h內的SD大鼠,由吉林大學實驗動物中心提供,合格證號:SCXK-吉2007-0003。Sch B(中國藥品生物制品檢定所),DMEM粉劑培養基(美國Gibco公司),MTT和胰蛋白酶(美國Sigma公司),新生牛血清(四季青公司產品),LDH試劑盒、CK試劑盒、SOD試劑盒和MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。CO2培養箱(美國Shell公司), Motic AE37攝像倒置顯微鏡和860型酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 乳鼠心肌細胞原代培養取新生72 h內的SD大鼠乳鼠4～8只,剪取心臟,冷PBS溶液沖洗3次,50 m L離心管中剪碎。PBS沖洗2次, 以0.25%胰蛋白酶37℃消化8 min,收集上清,用血清終止消化,反復消化至組織塊消化完全。整個消化過程控制在1.5～2.0 h內。收集液以200目濾網過濾,1 000 r·min－1離心5 min,去上清,重懸,差速貼壁90 min純化細胞后調整密度為1×105～1×106m L－1,接種于細胞培養板中, 96孔板每孔200μL。

1.3 實驗分組及處理方法對照組:細胞正常培養,不加任何處理;模型組:將正常培養液換為終濃度為2 mmol·L－1的Na2S2O4溶液,細胞缺氧培養2 h后換正常DMEM培養液即造成H/R損傷,CO2培養箱內繼續培養18 h。不同濃度Sch B預處理組:在培養液中加入終濃度為10、50和250 mg·L－1Sch B溶液預培養24 h后同模型組處理。

1.4 心肌細胞形態學觀察倒置顯微鏡下觀察各組心肌細胞的生長狀態,包括細胞貼壁情況、伸展程度、搏動的頻率和同步性。

1.5 MTT比色法測定心肌細胞存活率各組心肌細胞PBS清洗2次,加入無血清的培養液及20μL MTT溶液,繼續培養4 h。倒板后每孔加入150μL二甲基亞砜,震板10 min,酶標儀570 nm處測定吸光度(A)值,計算細胞存活率。細胞存活率＝實驗組A值/正常組A值×100%。

1.6 心肌細胞中LDH、CK和SOD活性及MDA水平測定各組心肌細胞H/R損傷后,按照試劑盒說明書操作,取培養液上清,測定LDH漏出量及CK活性。取各組細胞,經超聲波破碎儀(功率300 W,工作時間3 s,間隔時間30 s,重復5次)將其破碎,按試劑盒說明操作,測定胞漿中MDA水平和SOD活性。

1.7 統計學分析采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。各組細胞存活率,LDH、CK、SOD活性和MDA水平以±s表示,多組間樣本均數比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 各組心肌細胞形態學表現與對照組(圖1A,見插頁三)比較,模型組細胞體積回縮明顯,僅少數細胞搏動30～40次·min－1,搏動不規則甚至停止,有大量單個細胞浮起甚至部分區域細胞層浮起,表明細胞損傷嚴重(圖1B,見插頁三)。與模型組比較,Sch B預處理各組的心肌細胞H/R損傷后,隨藥物濃度增加心肌細胞形態變化不同程度減輕;250 mg·L－1Sch B預處理組細胞輕度回縮,偽足尚存,搏動90～110 min－1,頻率較規整,同步性較好,無細胞浮起或細胞層脫落(圖1C,見插頁三);50 mg·L－1組細胞回縮較明顯,部分細胞偽足消失,細胞連接減少,搏動80～100 min－1,出現不規律搏動,無細胞浮起或脫落(圖1D,見插頁三);10 mg·L－1Sch B預處理組細胞回縮明顯,較多偽足消失,搏動約為70 min－1,有較多不規則搏動,同步性較50和250 mg·L－1預處理組差(圖1E,見插頁三)。

2.2 各組心肌細胞存活率與對照組(95.75%± 2.62%)比較,模型組心肌細胞存活率(70.67%± 2.55%)明顯下降(P＜0.01),細胞損傷嚴重;與模型組比較,10、50和250 mg·L－1Sch B預處理組細胞存活率(78.43%±3.53%、83.64%± 2.03%和89.77%±3.42%)均明顯上升(P＜0.01)。上述結果表明10～250 mg·L－1Sch B對心肌細胞H/R損傷有保護作用,且呈濃度依賴性。

2.3 各組心肌細胞中LDH、CK和SOD活性及MDA水平模型組細胞H/R損傷嚴重,與對照組比較,LDH和CK活性及MDA水平明顯升高(P＜0.01),SOD活性明顯降低(P＜0.01);與模型組比較,Sch B預處理各組LDH和CK活性及MDA水平明顯降低(P＜0.01),SOD活性明顯升高(P＜0.05或P＜0.01);10、50和250 mg·L－1Sch B預處理組隨著Sch B濃度增加LDH和CK活性及MDA水平明顯下降(P＜0.05),SOD活性明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。見表1。

表1 各組心肌細胞中LDH、CK和SOD活性及MDA水平Tab.1 Activities of LDH,CK and SOD and MDA levels in myocardial cells in various groups(n＝6,±s)

?P＜0.01 compared with control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 compared with model group;＃P＜0.05,＃＃P＜0.01 compared with 10 mg·L－1Sch B group;▲P＜0.05 compared with 50 mg·L－1Sch B group.

Group LDH [λB/(U·L－1)] CK [λB/(U·m L－1)] SOD [λB/(U·mg－1prot)] MDA [mB/(μmol·g－1prot)] Control 123.20±18.84 0.37±0.03 20.97±2.29 2.48±0.40 Model 425.89±22.98?0.60±0.07?10.17±1.83?5.45±0.32?Sch B(mg·L－1) 10 350.65±33.25△△0.49±0.02△△12.03±1.87△4.84±0.30△△50 260.54±30.69△△＃0.44±0.02△△＃14.43±1.46△△＃4.18±0.15△△＃250 203.16±9.78△△＃▲0.41±0.01△△＃▲17.20±1.16△△＃＃▲3.86±0.33△△＃▲

3 討論

心肌組織的有氧代謝與線粒體功能關系密切。研究[7-9]表明:缺血再灌注、活性氧的積累和鈣超載等情況均可造成線粒體膜通透性增高和酶外漏,使其功能下降或喪失,引起細胞壞死。LDH是線粒體內重要酶,其水平改變會干擾心肌細胞正常代謝,造成心肌細胞大量損傷和死亡,其漏出量多少直接反映細胞損傷程度,因此可將其作為反映心肌細胞損傷程度有效指標[10]。CK是人體能量代謝過程中的重要酶類,通常存在于骨骼肌和心肌組織細胞漿和線粒體中。正常情況下,血清CK活性很低,當細胞損傷時,細胞膜遭到破壞,CK可從細胞內釋放出來,臨床上常以CK及其同功酶作為骨骼肌和(或)心肌損害敏感指標[11]。在心肌缺血/再灌注損傷發病機制中,自由基(oxygen free radical,OFR)引起的損傷起著關鍵作用。許多缺血性心臟疾病如心肌梗死和心力衰竭發生時,大量氧自由基可導致心肌細胞膜脂質過氧化,膜結構破壞,細胞滲透性改變,引起心肌細胞凋亡和壞死[12-14]。機體為了對抗氧自由基對自身的損傷,形成了完整的氧自由基清除系統,其主要成分是機體中的抗氧化酶。SOD是這個清除系統中重要的抗氧化酶,其活性高低可反映機體對氧自由基的清除能力[15]。正常狀態下氧自由基生成系統與清除系統處于動態平衡之中。當組織細胞受到損傷時,該動態平衡被破壞,因為ATP等能量物質大量耗竭可使該酶系遭到破壞,清除能力降低,大量來不及清除的OFR聚積;再灌注時,造成氧自由基爆發性釋放,嚴重影響物質代謝,損害機體,引起疾病[10]。OFR還可攻擊細胞膜上的多聚不飽和脂肪酸,生成多種脂質過氧化物,如MDA等大量細胞毒性物質。MDA對細胞膜有很強破壞作用,使其流動性降低和通透性增高,細胞內外離子分布發生異常,影響細胞信號轉導系統,抑制心肌細胞功能,最終導致心肌細胞從可逆性損傷發展為細胞死亡,故MDA可作為脂質過氧化反應強弱的指標[16-17]。

本研究結果顯示:H/R損傷后模型組培養液中LDH和CK活性明顯增加,與對照組比較差異有統計學意義,這與細胞膜破壞導致其外漏有關; 10、50和250 mg·L－1SchB預處理組培養液中LDH和CK活性明顯下降,與模型組比較差異有統計學意義,說明Sch B預處理可減輕細胞損傷,其機制與保護心肌細胞膜結構和功能有關。同時本研究結果顯示:與對照組比較,模型組SOD活性明顯降低,MDA水平明顯升高,說明心肌細胞清除氧自由基能力嚴重下降,大量氧自由基對細胞劇烈攻擊,產生了大量脂質過氧化產物,細胞受到嚴重損傷;與模型組比較,10、50和250 mg·L－1Sch B預處理組SOD活性均明顯升高,MDA水平明顯下降,說明Sch B預處理可減輕心肌細胞氧化損傷。

綜上所述,Sch B對H/R損傷心肌細胞的保護機制與其保護心肌細胞膜完整性、減少LDH和CK的外漏、提高SOD活性、減少MDA的生成,從而減輕細胞氧化損傷,使心肌細胞處于功能活躍狀態的作用有關。因此,Sch B可以作為保護心肌細胞的新藥進行開發,但其對H/R損傷心肌細胞保護作用的其他機制還有待進一步研究。

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Protective effect of Schisandrin B on myocardial cells with hypoxia/reoxygenation-induced injury in neonatal rats and its mechanism

LIU Wei1,ZHANG Cheng-yi2,SHEN Nan1,JIN Hong1,YUAN Rui1,WAN Xiao-ming1,QI Ling3
(1.Experimental Center,Jilin Medical College,Jilin 132013,China;2.Department of Pharmacology, School of Pharmacy,Beihua University,Jilin 132001,China;3.Department of Pathology,Jilin Medical College,Jilin 132013,China)

ObjectiveTo investigate the influence of Schizandrain B(Sch B)preconditioning in myocardial cells of neonatal rats with hypoxia/reoxygenation(H/R)injury,and to explore its possible mechanism.MethodsThe cultured myocardial cells were divided into control group,model group and 10,50,250 mg·L－1SchB preconditioning groups.All the cells in various groups except control group were cultured in 2 mmol·L－1Na2S2O4for 2 h,then cultured in normal medium for 18 h to induce myocardial H/R injury.The morphological changes of myocardial cells in various groups were observed under inverted microscope.The survival rates of the myocardial cells in each group were examined by MTT.The activities of lactic dehydrogenase(LDH),creatine(CK), superoxide ismutase(SOD),and the(MDA)levels in the cells in various groupswere examined by detection kits.ResultsCompared with control group,the cells in model group were retracted,arrest or float,the survival rate was decreased significantly(P＜0.01),the activities of LDH,CK and MDA level were increased(P＜0.01),andthe SOD activity was decreased(P＜0.01);compared with model group,the cells in Sch B preconditioning groups remained beating,retraction was light,the cell survival rates were significantly increased(P＜0.01),the activities of LDH,CK and MDA levels were decreased(P＜0.01),and the SOD activities were increased(P＜0.05 or P＜0.01).ConclusionSch B has protective effect on myocardial cells with H/R injury in the neonatal rats,which may be associated with anti-oxidative damage.

Schisandrin B;myocardial cells;hypoxia/reoxygenation injury;anti-oxygenation

R285.5

A

2013-09-25

吉林省教育廳科研基金資助課題(2011281,2012330,2012329)

劉 威(1976－),女,吉林省吉林市人,助理實驗師,醫學碩士,主要從事心肌細胞缺氧/復氧損傷的研究。

齊 玲(Tel:0432-64560027,E-mail:qiling1718＠163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-0977-04

10.13481/j.1671-587x.20140514