兩種酵母對奶牛瘤胃體外發酵特性的影響

王 祚，周傳社，湯少勛，譚支良

（1．中國科學院亞熱帶農業生態研究所亞熱帶農業生態過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養殖工程技術中心，農業部中南動物營養與飼料科學觀測實驗站,湖南長沙410125；2．中國科學院大學，北京100049）

由于畜禽生產中抗生素的濫用及其殘留對動物和人類健康構成了嚴重隱患，歐盟已經立法全面禁止抗生素在畜禽生產中的使用，我國及其他國家也已陸續出臺相關法律法規限制在畜禽生產中使用抗生素。因此，作為抗生素的替代產品，飼用微生物（Direct-fed Microorganism,DFM），又稱益生素（Probiotics），正日益成為一種新型的飼料添加劑得到了較為充分的研究與應用，酵母菌更是作為熱點之一激發了動物營養學家們的廣泛研究興趣。然而，大部分關于酵母菌的研究都集中在酵母培養物方面，而關于活性酵母的研究則相對較少。已有的關于活性酵母的研究結果證明，添加活性酵母對反芻動物的瘤胃發酵、生產性能、產品質量及其安全性等方面都有積極的影響[1-2]。然而不同的試驗所得的結果卻不盡相同，這是由于酵母菌的益生作用與試驗動物的種類、日糧類型、飼喂管理方式等密切相關，如在育肥期內肉牛日糧中添加釀酒酵母可使其體重增加7.5%[3]。另有研究發現，添加釀酒酵母時，飼喂青貯料比飼喂高纖維的農副產品和高比例的大麥效果更好[4]。另外酵母的添加作用也會因酵母菌菌種的結構及生物活性的不同而產生差異。Newbold等[5]的體外發酵試驗結果顯示，添加NCYC240與NCYC1026兩種釀酒酵母菌株能夠增加瘤胃中細菌總數及纖維降解菌的數量。

已經證實，在奶牛日糧中添加酵母產品能起到如下作用：提高營養物質消化率、調整瘤胃中揮發性脂肪酸（VFA）的濃度與比例、減少瘤胃中氨的濃度、增加瘤胃內微生物種群數量等[6]，但是其作用機制尚未得到完整的研究和解釋?；钚越湍副蛔C實可以通過穩定瘤胃pH以改善瘤胃發酵條件[7]，也有研究表明高溫條件下在日糧中添加活性酵母可以改善瘤胃環境，提高干物質采食量、飼料報酬和生產性能[8]。由于活性酵母菌通常需要利用氧氣以代謝糖類或其它營養物質，有研究者推測活性酵母菌可以通過消耗氧氣而平衡瘤胃中的氧化還原反應，從而為瘤胃內的微生物群落創造嚴格厭氧的最佳發酵環境[9-10]。

本試驗的目的即運用瘤胃體外發酵技術，初步探究并比較兩種酵母對奶牛瘤胃體外發酵特性的影響，從而預測活性酵母對奶牛生產性能可能的影響，以期為研究酵母在反芻動物生產中的實際應用與營養生理調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1發酵底物 2種待發酵粗飼料底物分別為玉米秸稈（湖南長沙科湘甜玉1號）與水稻秸稈（湖南瀏陽湘125s）。底物經65℃烘干24h，經1mm孔徑篩粉碎后備用。按照楊勝等[11]確定的常規方法測定其干物質（DM）、有機物（OM）、粗蛋白（CP）以及粗脂肪（EE）等含量；依照Hall等[12]的方法進行調整，使用Fibretherm FT12全自動纖維儀（GerhardtAnalytical Systems,Germany）測定中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量。具體成分含量見表1。

表1 兩種粗飼料底物的主要營養成分表 （單位：g/kg DM）

1.1.2酵母來源 本試驗所用的兩種酵母分別為法國樂斯福集團（Lesaffre Feed Additives,France）及中國安琪公司（Angel YeastCo.,Ltd,P.R.China）所生產的商業活性酵母產品，菌種均為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），活菌數濃度分別為1.5×1010cfu/g和 2.0×1010cfu/g。

1.2 試驗動物、日糧及飼養管理

1.2.1瘤胃液供給動物 選擇3頭體況良好、年齡相同（3胎次）、體重相近（500±50kg）的荷斯坦奶牛，安裝永久瘤胃瘺管后，護理20d，瘤胃瘺管安裝適應期為1個月。

1.2.2試驗動物日糧及飼養管理 試驗日糧參照NRC泌乳奶牛飼養標準配制[13]?；A日糧由水稻秸稈和精料補充料組成，日糧精粗比為40∶60。日糧組成及營養成分如表2所示。

1.3 體外發酵試驗設計及方法

兩種活性酵母產品均設置4個添加水平，采取單因子區組試驗設計，在39℃恒溫培養箱中培養48h。兩種酵母的不同添加水平作為一個處理，每個處理設置12h、24h、48h三個采樣時間點重復，每個采樣時間點再設置3個樣品重復。表3為本試驗活性酵母的添加方案。

表2 試驗動物日糧組成及營養成分

表3 活性酵母添加方案 （單位：%）

1.3.1體外發酵培養液的配制及預處理 按照Menke與Steingass[14]的方法于體外發酵前一天配制瘤胃體外發酵厭氧緩沖液。在晨飼前通過瘺管采集奶牛瘤胃液，用四層紗布過濾后與厭氧緩沖液以1∶9的比例充分混合成發酵培養液。混合好的培養液在發酵前迅速通入CO22-3min后，置于39℃的水浴搖床上等待培養[15]。

1.3.2發酵準備及培養 于體外發酵前24h預先在各厭氧發酵瓶中稱取0.5±0.0003 g底物，在39℃恒溫培養箱中放置過夜。并于體外發酵前24h預先將活性干酵母粉用蒸餾水配制成溶液。次日向發酵瓶中持續通入CO22min，隨即先后加入已配制好的不同梯度的酵母溶液和50ml體外發酵培養液，并再次持續通入CO23min，加上瓶塞后迅速使用針頭放氣將氣壓調節成0，此即0 h點的氣壓值。隨后立即放置于39℃恒溫培養箱中開始體外發酵48h。

1.3.3實驗數據計算及樣品采集分析

（1）體外發酵總產氣量。分別于體外發酵中的0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h使用壓力傳感器（CYG130-12，昆山雙橋傳感器測控技術有限公司）測定發酵瓶內的氣壓，并將氣壓換算成為室溫標準氣壓下的氣體體積，換算公式為：

y=1.506x

其中1.506為實測壓強與體積之間的換算系數，x為壓強，y為產氣量。

將各時間點測得總產氣量運用LE體外發酵產氣模型[16]進行擬合，計算動態發酵產氣參數。模型公式如下：

y=vf*[1-exp(d-t*k)]/[1+exp(b-k*t)]

上式中y表示t時間點底物的產氣量（m l）；vf表示理論最大產氣量（m l）；k表示產氣分率；b和d是曲線的形狀指標，b>0表示曲線為s形，b<0則表示曲線非s形。

另有計算公式：

FRD0=k/[1+exp(b)]

t0.5={ln[2+exp(b)]}/k

FRD0表示發酵初期氣體產生速率；t0.5表示達到最大產氣量一半所需的發酵時間[17]。

（2）體外發酵干物質消失率（DMD）。分別于體外發酵中的12 h、24 h、48 h取出發酵瓶，發酵液過400目尼龍布后將殘渣全部轉移至石英坩堝中用熱蒸餾水反復沖洗，隨后置于105℃烘箱中烘干8 h以測定干物質消失率。測定過干物質消失率后的殘渣回收用樣品袋密封保存，以備DM消失率的測定。

DMD=[1-(m/M)]×100%

式中m表示發酵后底物干物質質量；M表示發酵前底物干物質質量。

（3）體外發酵中性洗滌纖維消失率（NDFD）。NDF的測定方法參照Hall等的方法[12]，使用Fibretherm FT12全自動纖維儀（GerhardtAnalyticalSystems,Germany）進行測定。

NDFD=[1-(m2/m1)]×100%

式中m1表示發酵前底物中含有的NDF質量，m2表示發酵后底物中剩余的NDF質量。

（4）體外發酵液pH值。分別于體外發酵中的12 h、24 h、48 h取出發酵瓶，每瓶取出2ml發酵液立即用pH計（REX PHS-3C，上海儀器設備廠）測定其pH值。

（5）體外發酵液NH3-N濃度。分別于體外發酵中的12 h、24 h、48 h取出發酵瓶，每瓶取出2m l發酵液用于NH3-N濃度的測定。按照馮宗慈等改進的比色法[18]，使用UV2450紫外可見分光光度計（Shimadzu Corporation,Japan）進行測定。

1.4 試驗數據統計及分析

試驗數據采用SAS（8.2版）的MIXED過程統計，不同活性酵母間的差異與相同活性酵母不同添加水平間的差異采用CONTRAST語句進行比較。統計差異顯著性定義為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 兩種酵母不同添加水平對粗飼料體外發酵產氣量和相關參數的影響

2.1.1兩種酵母不同添加水平對玉米秸稈體外發酵產氣量和相關參數的影響 圖1與圖2分別為以玉米秸稈為發酵底物時，安琪和樂斯福兩種酵母不同添加水平對體外發酵產氣曲線的影響。

圖1 安琪酵母不同添加水平對玉米秸稈體外發酵產氣量的影響

圖2 樂斯福酵母不同添加水平對玉米秸稈體外發酵產氣量的影響

表4為以玉米秸稈為發酵底物時，安琪和樂斯福兩種酵母不同添加水平對體外發酵產氣相關參數的影響。

表4 安琪酵母與樂斯福酵母不同添加水平對玉米秸稈體外發酵相關產氣參數的影響

通過圖1、圖2和表4可以看出，以玉米秸稈作為發酵底物時，添加安琪和樂斯福兩種酵母對體外發酵參數Vf值、d值、k值、FRD0值和 t0.5值均無顯著影響（P>0.05），而添加樂斯福酵母的發酵參數b值顯著低于安琪酵母（P<0.05）。安琪酵母不同添加水平對Vf值、b值、d值和k值均無顯著影響（P>0.05）；而對FRD0值和t0.5值均存在顯著的一次效應（P<0.05）。樂斯福酵母不同添加水平對Vf值沒有顯著影響（P>0.05）；而對b值、FRD0值和t0.5值均存在顯著的三次效應（P<0.05），對d值和k值均存在顯著的二次效應（P<0.05）。酵母類型與添加水平對Vf值、d值和k值均沒有表現出顯著的互作效應（P>0.05）；而對b值、FRD0值和t0.5值表現出顯著的互作效應（P<0.05）。隨著安琪酵母添加水平的增加，FRD0值呈顯著的增加趨勢，當添加水平為0.075%時達到最大；而t0.5值則呈顯著的下降趨勢，當添加水平為0.075%時達到最小。

2.1.2兩種酵母不同添加水平對水稻秸稈體外發酵產氣量和相關參數的影響 安琪和樂斯福兩種酵母不同添加水平對水稻秸稈體外發酵產氣曲線的影響如圖3、圖4所示。

以水稻秸稈為發酵底物時，安琪和樂斯福兩種酵母不同添加水平對體外發酵產氣相關參數的影響如表5所示。

通過圖3、圖4和表5可以看出，以水稻秸稈作為發酵底物時，添加安琪和樂斯福兩種酵母對各體外發酵參數均無顯著影響（P>0.05）。樂斯福酵母不同添加水平對體外發酵各參數均存在顯著的三次效應（P<0.05），各參數隨添加水平的升高呈先降低、隨后升高、又再次降低的趨勢。安琪酵母不同添加水平對Vf值、b值和FRD0值均無顯著影響（P>0.05）；而對d值存在顯著的二次效應（P<0.05），對k值和t0.5值存在顯著的一次效應（P<0.01）。酵母類型與添加水平對Vf值和t0.5值表現出顯著的互作效應（P<0.05），對d值和FRD0值表現出極顯著的互作效應（P<0.01）；而對b值和k值沒有表現出顯著的互作效應（P>0.05）。隨著樂斯福酵母添加水平的增加，FRD0值呈整體上升趨勢，當添加水平為0.075%時FRD0值達到最大。

圖3 安琪酵母不同添加水平對水稻秸稈體外發酵產氣量的影響

圖4 樂斯福酵母不同添加水平對水稻秸稈體外發酵產氣量的影響

表5 安琪酵母與樂斯福酵母不同添加水平對水稻秸稈體外發酵相關產氣參數的影響

2.2 兩種酵母不同添加水平對粗飼料體外發酵DMD和NDFD的影響

2.2.1兩種酵母不同添加水平對玉米秸稈體外發酵DMD和NDFD數的影響 以玉米秸稈為體外發酵底物時，安琪和樂斯福酵母不同添加水平對DMD和NDFD的影響見表6。

通過表6可以得出，添加樂斯福酵母時玉米秸稈的DMD顯著高于添加安琪酵母（P<0.05），但兩種活性酵母不同添加水平之間玉米秸稈DMD并不存在顯著性差異（P>0.05），同時DMD呈隨樂斯福酵母添加水平提高而升高的趨勢。酵母與添加水平之間也未表現出顯著的交互效應（P>0.05）。酵母類型對NDFD沒有顯著影響（P>0.05），樂斯福酵母添加水平和酵母與添加水平之間的互作均對NDFD沒有顯著性影響；但安琪酵母添加水平對NDFD的影響呈極顯著的二次效應（P<0.01）。

表6 安琪與樂斯福酵母不同添加水平對玉米秸稈體外發酵DMD和NDFD的影響

2.2.2兩種酵母不同添加水平對水稻秸稈體外發酵DMD和NDFD數的影響 添加兩種酵母對水稻秸稈體外發酵DMD及NDFD的影響如表7所示。

通過表7可知，兩種酵母對水稻秸稈DMD的影響達到了極顯著水平（P<0.01），并且酵母和添加水平之間亦存在極顯著的交互效應（P<0.01）；安琪酵母不同添加水平對水稻秸稈DMD無顯著影響（P>0.05），而樂斯福酵母添加水平對DMD的影響呈極顯著的一次效應（P<0.01）。對于NDFD而言，兩種酵母、酵母添加水平以及酵母和添加水平的交互效應對NDFD均無顯著影響（P>0.05）。

表7 安琪酵母與樂斯福酵母不同添加水平對水稻秸稈體外發酵DMD和NDFD的影響

2.3 兩種酵母不同添加水平對粗飼料體外發酵pH和NH3-N的影響

2.3.1兩種酵母不同添加水平對玉米秸稈體外發酵pH和NH3-N的影響 表8所示為以玉米秸稈為發酵底物時，添加安琪和樂斯福兩種酵母對體外發酵液pH和NH3-N的影響。

由表8可以得出，添加兩種酵母對以玉米秸稈為底物的體外發酵液pH值無顯著性影響（P>0.05），酵母與添加水平之間的互作效應也未達到顯著性水平（P>0.05），安琪酵母各添加水平之間對pH值表現出極顯著的一次效應（P<0.01），而樂斯福酵母各添加水平之間對pH值則表現出顯著的二次效應（P<0.05）。對NDFD而言，兩種酵母、酵母添加水平以及酵母和添加水平的交互效應對NDFD均無顯著影響（P>0.05）。

表8 安琪酵母與樂斯福酵母不同添加水平對玉米秸稈體外發酵pH和NH3-N的影響

2.3.2兩種酵母不同添加水平對水稻秸稈體外發酵pH和NH3-N的影響 以水稻秸稈作為發酵底物時，添加安琪和樂斯福兩種酵母對體外發酵液pH和NH3-N的影響如表9所示。

通過表9可以發現，添加安琪和樂斯福兩種酵母對以水稻秸稈為底物的體外發酵液pH值和NH3-N濃度均有顯著影響（P<0.05），且兩種酵母添加水平、酵母和添加水平的交互作用對pH值和NH3-N濃度呈顯著影響（P<0.05）。安琪酵母不同添加水平間的pH值和NH3-N濃度均表現出顯著的二次效應（P<0.05），樂斯福酵母各添加水平間的pH值和NH3-N濃度則呈現出極顯著的一次效應（P<0.01）。

3 結論與討論

表9 安琪酵母與樂斯福酵母不同添加水平對水稻秸稈體外發酵pH和NH3-N的影響

3.1 結論

本試驗通過奶牛瘤胃體外發酵技術，初步探究并比較了安琪酵母與樂斯福酵母對于瘤胃發酵特性的影響。得出以下結論：

（1）添加安琪和樂斯福兩種酵母對玉米秸稈和水稻秸稈兩種底物體外發酵的產氣量和LE產氣參數均無顯著影響，然而均顯著地提高了玉米秸稈和水稻秸稈的DMD。

（2）添加兩種酵母對以玉米秸稈為發酵底物的體外發酵液pH值及NH3-N濃度均未表現出顯著性效應，但是分別顯著地降低了以水稻秸稈為發酵底物的體外發酵液pH值及NH3-N濃度。樂斯福酵母對于以玉米秸稈和水稻秸稈DMD的提高作用均顯著高于安琪酵母；對NH3-N濃度的降低作用也顯著地高于安琪酵母。

（3）從總體數據結果來看，水稻秸稈的發酵效果要好于玉米秸稈；樂斯福酵母的添加效果要明顯優于安琪酵母，并且0.075%為其最佳添加水平。

3.2 討論

體外發酵產氣量一定程度上可以反映出發酵底物為瘤胃微生物所利用的程度[19]，因此通過測定兩種酵母不同添加水平下體外發酵的產氣量，可以粗略地估計其對于DMD的影響。本試驗研究結果顯示，添加活性酵母并未對以玉米秸稈和水稻秸稈為底物的體外發酵產氣量產生顯著性影響，且目前也缺乏與之相關的研究報告與本試驗的這一結果進行比較。FRD0表示體外發酵12h之前的發酵初期產氣速率，t0.5值則表示產氣量達到最大理論產氣量一半所需要的發酵時間[17]。本試驗以玉米秸稈為底物的體外發酵中，FRD0值均表現出隨著兩種活性酵母添加水平的提高而增大的趨勢，且t0.5值也表現出隨著酵母添加水平的提高而減小的趨勢，這一現象表明隨著兩種酵母添加水平的提高，在發酵前期均能加快玉米秸稈降解速率、進而加快產氣速率、增加產氣量的趨勢，而這一趨勢之所以未能達到顯著水平，可能是因為試驗中酵母的添加水平還不足以導致顯著性影響。在以水稻秸稈為底物的體外發酵中，添加兩種酵母卻有增大t0.5值的趨勢，表明兩種酵母有降低發酵前期產氣量的趨勢。玉米秸稈與水稻秸稈兩者之間的這一差別可能與兩種底物之間的營養成分差異相關。

DM和NDF降解率是體現瘤胃發酵過程中粗飼料利用率的重要指標。在本試驗中，添加酵母顯著地提高了玉米秸稈的DMD，并極顯著地提高了水稻秸稈的DMD。有研究表明添加酵母菌能夠增加瘤胃中纖維分解菌的數量[20]，而纖維分解菌所分泌的纖維素酶能夠顯著的提高粗飼料體外發酵的DMD[21]，本試驗的這一結果與之相吻合。另外，一般認為發酵產氣量與DMD緊密相關[22]，但本試驗中添加酵母并未對體外發酵產氣量產生顯著性影響，這可能是因為本試驗所選用的兩種酵母改變了底物的降解方式，從而使底物更多地通過生成氣體（CO2、CH4等）較少的反應途徑實現降解。尤其當以玉米秸稈為發酵底物時，添加樂斯福酵母的DMD要顯著高于安琪酵母；而以水稻秸稈為發酵底物時，添加樂斯福酵母的DMD更是極顯著地高于安琪酵母，這說明樂斯福酵母對于粗飼料降解的效果要明顯優于安琪酵母。然而，不管是以玉米秸稈作為發酵底物或是以水稻秸稈作為發酵底物，添加兩種酵母對兩者的NDFD均無顯著性作用。這種結果的出現一方面可能是因為本試驗所選用的兩種酵母并不能增強NDF相關酶的分泌或活性；另一方面也有可能是本試驗酵母的添加水平還不足以導致對NDFD的顯著性影響。

瘤胃pH值是評價瘤胃發酵狀況的基本指標，決定著瘤胃微生物對底物的發酵利用效率[23]。維持正常的瘤胃pH值是保證瘤胃正常發酵的必要前提，而奶牛瘤胃液pH值的正常范圍為5.5-7.5[24]。Van Houtert認為，瘤胃微生物最大生長速度的pH值在5.7以上[25]。本試驗以玉米秸稈作為發酵底物時，所有的pH值都處于正常范圍內；以水稻秸稈作為發酵底物時，樂斯福酵母處理組的pH值顯著的低于安琪酵母處理組，并且隨著添加水平的升高而逐漸降低，所有處理的pH值也均處于正常范圍內。這說明添加酵母對于維持瘤胃內環境的穩衡具有一定的積極作用。

瘤胃NH3-N濃度在一定程度上反映出特定日糧條件下蛋白質降解與合成間的平衡狀態[26]，NH3-N是瘤胃微生物合成微生物蛋白和機體蛋白的主要原料，其最佳濃度范圍為63-275mg/L[27-29]。本試驗中各處理組的NH3-N濃度均落在最佳范圍之內，并且以水稻秸稈作為發酵底物時，樂斯福酵母處理組的NH3-N濃度要顯著低于安琪處理組，并且隨著添加水平的提高而降低；而前面已經提到以水稻秸稈作為底物時，樂斯福酵母處理組的DMD要極顯著高于安琪酵母組，而且隨著添加水平的提高而升高。這一聯系表明NH3-N濃度與DMD之間可能存在有密切的關聯，可能是因為添加樂斯福酵母提高了DMD而加快了物質與能量的代謝進程，從而需要更多的微生物蛋白及機體蛋白以維持代謝平衡，因此促進了對NH3-N的利用而降低了NH3-N濃度，但是此推測需要足夠的相關試驗研究加以論證。

本試驗初步探究并比較了兩種酵母對奶牛瘤胃兩種底物體外發酵的影響，然而酵母作用于瘤胃發酵特性的具體途徑及機制還不夠明確，這還有待于通過進一步的體外試驗以及動物試驗而得到更充分更透徹的研究。

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