重金屬脅迫對兩種海洋餌料微藻的急性毒性效應研究＊

于小娣，師 玥，劉 泳，周 斌，王其翔，張鑫鑫，唐學璽，王 悠＊＊

（1.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島266003；2.青島市海泊河污水處理廠，山東 青島266021；3.山東省海水養殖研究所，山東 青島266002）

重金屬是海洋三大污染物之一，其危害已受到人們廣泛關注。據報道，2009年我國海域受重金屬污染的面積繼續增大，對海洋生態系統危害極大[1]。海洋微藻是海洋初級生產力的重要組成部分，也是海洋生態系統中食物鏈的起點。當水體受到重金屬污染時，海洋微藻是首要的污染對象，并通過食物鏈富集、傳遞作用對食物鏈各營養級的生物產生毒害作用[2－3]。有關重金屬對海洋微藻毒性效應的研究有許多報道，重金屬脅迫會破壞微藻的葉綠體結構，使其變形，同時使細胞壁松散，細胞內液泡數量增多，體積增大[4]；還能破壞海藻葉片細胞的膜結構和非膜結構，對其呼吸、代謝等重要生理過程產生影響[5]。

銅（Cu2＋）、鎘（Cd2＋）和鋅（Zn2＋）是3種典型的污染重金屬，其中Cu2＋和Zn2＋是微藻生長所必需的元素，痕量的Cu2＋或Zn2＋能維持微藻體內正常的生理代謝過程，但水體中過高濃度的重金屬會破壞其膜系統及細胞器，影響微藻的光合作用和正常物質代謝過程。Cd2＋的毒性很強，且具有高生物富集性，可造成生物體的急性、亞急性致死作用[6－8]。從目前的研究來看，重金屬對餌料微藻的毒性效應研究相對集中于某一生物組織層次上，從亞細胞、細胞和種群等多生物組織層次系統上來分析重金屬的毒性效應及損傷途徑的研究較少[7]。

本研究以山東近岸常見的2種海洋餌料微藻：青島大扁藻（Platymonashelgolandicavar.tsingtaoensis）和等鞭金藻8701（Isochrysisgalbana8701）為目標，在實驗生態條件下研究3種重金屬離子：Cu2＋、Cd2＋和Zn2＋的急性毒性脅迫對其種群增長的影響，結合透射電鏡技術（Transmission Electronic Microscope，TEM）分析重金屬脅迫對微藻亞細胞結構的損傷，從不同生物組織層次上分析重金屬的毒性效應。研究結果為研究重金屬污染對微藻群落結構的變化影響提供數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用2種常見的餌料微藻：綠藻門的青島大扁藻（Platymonashelgolandicavar.tsingtaoensis）和金藻門的等鞭金藻8701（Isochrysisgalbana8701），均取自中國海洋大學生態毒理學實驗室。

微藻培養用的海水均為取自青島市魯迅公園的自然海水，經沉淀、過濾（0.45μm 微孔濾膜），121.3℃滅菌20min后用于藻類的培養。微藻培養的三角瓶預先用1mol/L的HCL浸泡24h，再用蒸餾水沖洗干凈后于121.3℃滅菌20min。培養過程中，將已知起始密度的目標微藻接種于經f/2培養液[9]加富的滅菌海水中，培養溫度（19±1）℃，光照66μmol/（m2·s），光暗周期12h∶12h。培養過程中定時搖動以防止其附壁生長。

1.2 實驗設計

CuSO4·5H2O（AR），ZnSO4·7H2O（AR），3CdSO4·8H2O（AR）分別用重蒸水配成相應的母液。在預實驗基礎上等間距設置5個濃度組（見表1）。

表1 急性毒性實驗設計Table 1 Acute toxic effects design /mg·L－1

實驗微藻的初始密度為1.0×105cells/mL，實驗總體積為120mL，每個實驗組設3個平行樣（n＝3），以不加入重金屬污染物的一組為對照組。整個實驗周期為120h，每24h取樣1mL，先用Lugol碘液固定，再用血球計數板計數，根據計數結果計算微藻種群的密度、相對增長率、相對抑制率及48h－EC50和96h－EC50。

1.3 Cu2＋脅迫下2種海洋微藻的透射電鏡觀察

取10mL Cu2＋脅迫了96h的藻液，用0.22μm的濾膜過濾，收集濾膜上的藻細胞，用0.1mol/L磷酸鉀緩沖液（pH＝7.4）沖洗藻體，再過濾，重復2次。在室溫下用5%的戊二醛固定4 8h后進行透射電鏡觀察（HITACHI－700TEM）。

圖1 Cd2＋脅迫對2種微藻種群增長及相對增長率的影響Fig.1 Acute toxic effect of Cd2＋ on population growth and relative growth rates of two species of microalgae

實驗中，Cu2＋對等鞭金藻8701的脅迫濃度為0.2和0.6mg/L；Cu2＋對青島大扁藻的脅迫濃度為0.5和1.5mg/L。

1.4 數據分析

用圖像處理軟件Singmaplot 10.0作圖。相對增長率計算公式如下：

其中：Nt為培養t時刻的細胞密度；N0為起始細胞密度；T為培養時間（h）。

相對抑制率計算公式如下：

其中：Kc為對照組相對增長率；Ki為處理組相對增長率。

半數有效抑制濃度EC50利用統計軟件Spss16.0中的概率單位－濃度對數回歸法計算求得。

2 結果

2.1 3種重金屬離子對2種微藻的毒性效應

在實驗濃度范圍內，青島大扁藻的種群密度隨著Cd2＋脅迫時間的增加而不斷增加，但相對增長率卻隨著時間的延長不斷降低，48h后各處理組的相對增長率均明顯低于對照組（Paired t－test，P＜0.05）。96h時，青島大扁藻（見圖1a）對照組的相對增長率為16%，低濃度組（Cd2＋＝14mg/L）的相對增長率為11%左右，而高濃度組（Cd2＋＝22mg/L）的相對增長率為4%，差異顯著。等鞭金藻8701的種群密度及相對增長率的變化趨勢同青島大扁藻類似（見圖1b），與對照組相比（相對增長率為32%），96h時低濃度組（Cd2＋＝0.3mg/L）的相對增長率為28%（P＜0.05），而高濃度組（Cd2＋＝3.1mg/L）生長幾乎停止，相對增長率只有1%，差異極顯著（P＜0.01）。青島大扁藻對Cd2＋的敏感性要低于等鞭金藻8701。

Zn2＋對2種微藻生長的影響情況與Cd2＋基本相同：與對照組相比，低濃度（Zn2＋＝8mg/L）的Zn2＋脅迫對青島大扁藻的生長抑制不明顯（Paired t－test，P＞0.05），在24h內還有一定的促進作用；96h時低濃度組的相對增長率為12%，對照組的相對增長率為12.6%。高濃度組（Zn2＋＝38mg/L）的Zn2＋脅迫對微藻生長具有抑制作用，96h時與對照組相比達到極顯著水平（Paired t－test，P＜0.01），此時微藻種群的相對增長率只有2.5%。Zn2＋對等鞭金藻8701的脅迫表現出類似的作用趨勢，與對照組相比，在24h時低、中濃度組（3.5～5.0mg/L）的細胞密度比0h略有增加，但相對增長率與對照組相比有所降低，且呈現出明顯的濃度依穩性，即濃度越高抑制作用越明顯。至96h時，高濃度組（5，6.5，8mg/L）的抑制作用與對照組相比達到極顯著程度（P＜0.01）（見圖2）。

圖2 Zn2＋脅迫對2種微藻種群增長及相對增長率的影響Fig.2 Acute toxic effect of Zn2＋ on population growth and relative growth rates of two species of microalgae

Cu2＋對2種微藻種群增長的抑制作用與Cd2＋和Zn2＋基本一致，但Cu2＋對2種微藻的毒性作用更大。如圖3所示，各處理組及對照組中的細胞密度均隨脅迫時間的延長而不斷增加，但處理組中的細胞密度始終小于處理組，并呈現出一定的劑量－效應關系，即脅迫濃度越高，種群密度越低；相對增長率的變化與種群密度變化趨勢一致，至96h時，低濃度組（Cu2＋＝0.2mg/L）的相對增長率為31%，與對照組相比差異性不顯著（P＞0.05），但高濃度組的相對增長率為7%左右，與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。

圖3 Cu2＋脅迫對2種微藻種群增長及相對增長率的影響Fig.3 Acute toxic effect of Cu2＋ on population growth and relative growth rates of two species of microalgae

根據上述實驗結果，計算了3種重金屬對2種微藻脅迫的48h－EC50和96h－EC50見（見表2）。

表2 3種重金屬對2種微藻脅迫的48h－EC50和96h－EC50Table 2 48h－EC50and 96h－EC50values when exposed to different concentrations of heavy metals’stress

3種重金屬離子脅迫下等鞭金藻8701的48h－EC50和96h－EC50都低于青島大扁藻，而3種金屬對于2種藻的48h－EC50和96h－EC50的大小比較為 Cu2＋＜Cd2＋＜Zn2＋（見表2）。等鞭金藻8701對于3種金屬脅迫的敏感性大于青島大扁藻，同時3種重金屬離子的毒性大小表現為Cu2＋＞Cd2＋＞Zn2＋。2種微藻的48h－EC50都低于其96h－EC50，這說明隨著脅迫時間的延長，3種重金屬對2種藻生長的抑制作用是減弱的。

2.2 Cu2＋脅迫條件下微藻的超微結構的變化

2.2.1 等鞭金藻8701的超微結構的變化 以毒性最強的Cu2＋為目標，研究了重金屬脅迫對青島大扁藻亞細胞結構的影響，結果發現：對照組的金藻細胞形態完整，呈橢圓形，長約5μm，寬約4μm，最外層有鱗片，沒有細胞壁，內里2個大的片狀色素體（見圖4A）緊貼細胞膜，并環藻體細胞分布，色素體中間有一個大的白糖體（見圖4B）。細胞核完整，呈橢圓形于細胞中間，有核膜包被，核仁清晰可見，有多個線粒體呈橢圓形或長條狀，沒有大液泡（見圖4B）。0.2mg/L的低濃度處理組中，藻細胞鱗片部分脫落，細胞質內空泡數量增多，液泡增大，細胞核與高爾基體出現輕微水腫，葉綠體片層結構少量斷裂，有細胞分泌物產生，依舊可見多個線粒體，且形態完整，各細胞器膜結構未發生大的變化（見圖4C）。0.6mg/L的高濃度組中，藻細胞鱗片脫落現象嚴重，內部細胞質空泡化更嚴重，大液泡大量產生，細胞核輕度變形，核膜水腫程度增加，但結構仍然完整，細胞分泌物增多甚至連成一片，葉綠體幾乎完全斷裂，且排布混亂，但其中的淀粉粒結構完整，并未太多受損，且線粒體結構仍然完整（見圖4D）。TEM檢測結果顯示，Cu2＋對等鞭金藻8701的光合作用供能系統損傷較大，但對線粒體和細胞核影響較小。中上部有一個大的淀粉（蛋白質）核，未觀察到脂肪粒（見圖5A）。藻細胞中央有一個細胞核，有核膜包被，中央部位靠近細胞膜的位置生有眼點（見圖5B）。當受到Cu2＋時（見圖5C－F），藻細胞外部形態變化不大，并未出現變形或破損的現象，但細胞壁增厚（見圖5D），且隨著脅迫濃度的增大，細胞內部淀粉粒的數量明顯減少，雖然大的淀粉核依舊可見但周圍的淀粉粒明顯變小且排列紊亂（見圖5E），脂肪粒的數量明顯增多，個體增大，說明其儲能機制出現問題，脂肪代謝產生阻礙。另外，隨著脅迫濃度的增加其細胞核雖有水腫但形態依然完整（見圖5D）。

圖4 Cu2＋脅迫前后等鞭金藻8701超微結構變化Fig.4 Changes of ultrastructure of I.galbana8701when exposed to Cu2＋ stress under TEM

2.2.2 青島大扁藻的超微結構的變化 對照組中的青島大扁藻藻體細胞呈橢圓形，且細胞外壁染色較深，這是它含有纖維素的細胞壁結構，細胞中可以看到有多個棒狀的淀粉粒分布在藻細胞的葉綠體中，在細胞

圖5 Cu2＋脅迫前后青島大扁藻超微結構變化Fig.5 Changes of ultrastructure of P.helgolandica when exposed to Cu2＋ stress under TEM

3 討論

當生物體受到污染物刺激時，會出現一個先抑制后補償的過程，但是隨著生物體對污染物的適應，補償行為會逐漸超過抑制行為，最終導致一個凈刺激效應，這個效應被稱為hormesis效應，即興奮效應[10]。在實驗中，Zn2＋脅迫對青島大扁藻的生長表現出低濃度刺激、高濃度抑制的現象。高濃度的3種重金屬則對微藻均表現出顯著的抑制作用，其中Cu2＋的毒性效應最強，Cd2＋次之，Zn2＋最弱。同時，通過2種藻48h－EC50和96h－EC50的比較發現，等鞭金藻8701對3種重金屬的敏感性比青島大扁藻高。從以往的研究可知，藻類細胞表面所包含的與重金屬有強親和性的官能團的數量和密度是決定微藻對重金屬的敏感性差異的主要原因[11]。因此很可能是2種微藻與Cu2＋的親和性最大，Cd2＋和Zn2＋次之，或是它們所具有的親和Cu2＋的官能團最多。

另一方面，微藻細胞有兩大供能系統：光合系統和呼吸系統。其中線粒體是有氧呼吸產能的主要場所，色素體如葉綠體等是主要的光合作用場所。重金屬對海洋微藻發生脅迫時，微藻首先會通過自身防御系統抵制重金屬的損傷，主要通過自身細胞壁所含官能團或分泌胞外物質與金屬離子發生螯合，已進入胞內的會與液泡釋放物質或細胞質中所含物質絡合形成沉淀，再排出胞外[12]。因此，重金屬對海洋微藻的損傷首先主要體現在對藻細胞及細胞器內膜系統的損傷，但當兩大供能系統的主要發生場所受損后，藻細胞代謝必然會產生異常。另外，這也說明，不同藻種在新陳代謝過程中，主動排除細胞內和表面重金屬的能力也會影響到自身受重金屬脅迫損傷的程度[13]。

Cu2＋是生物體內多種酶的組成成分，并且可以作為輔助因子參與植物的代謝過程，包括呼吸作用、光合作用和藻類的增殖等[14]。因此，選取Cu2＋作為脅迫因子對2種藻的亞顯微結構進行觀察研究是很有必要的，從本文的實驗結果來看，2種藻對Cu2＋脅迫都最為敏感，并且TEM檢測結果顯示，當Cu2＋濃度增加時，2種藻的光合系統或代謝過程都有不同程度的損傷。當藻類與金屬離子開始接觸時，藻首先表現為對金屬的表面吸附，低濃度時這種吸附不足以威脅到藻細胞，當金屬離子集聚到一定濃度時就會觸發藻細胞的自身防御機制。有些藻類可以通過細胞壁上帶負電荷的配位基團的結構將其重金屬離子沉淀于表面，阻止其進入，實驗中青島大扁藻（見圖5）便含有細胞壁結構[15]，這可能是青島大扁藻對3種重金屬的敏感性小于等鞭金藻8701的主要原因[16]。沒有細胞壁的藻體，可以通過分泌胞外物質將重金屬排出體外并阻止其進入，在等鞭金藻8701（見圖4）的TEM檢測結果中可以看到其藻體周圍有染色較深的胞外物質，隨著脅迫濃度的增大，這些胞外物質有數量增多、體積增大的趨勢。另外，藻細胞內的液泡含有多種物質，常能與重金屬發生絡合，降低毒性，當藻細胞受脅迫時，內部液泡會釋放這些物質，在本實驗TEM監測結果中也可以明顯看到，內部空泡化增強，液泡數量增多、體積增大的現象。當脅迫濃度不斷增大至超過藻細胞自身承受能力時，就會破壞這些防御機制，使膜結構滲透壓改變，重金屬大量進入，內部膜結構遭到破壞，兩大供能系統受損，代謝紊亂，各細胞貯能結構減少，細胞生長受到抑制，甚至停止生長[17－18]。

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