產纖維素酶里氏木霉的研究進展

王 芳，陳介南*，張 林，閆興偉，劉 娜

（中南林業科技大學 國家林業局生物乙醇研究中心，生物環境科學與技術研究所，湖南 長沙 410004）

隨著世界人口迅速增長以及化石燃料由短缺變枯竭，能源危機問題成為人類面臨的最主要挑戰。尋找廉價的、不污染環境的可再生新能量來源日益成為人們關注的焦點。生物質資源與化石燃料不同，其屬于可再生性資源。生物質最主要來源于綠色植物，地球上每年光合作用可產生高達150～200億t的植物干物質，其中一半以上是木質纖維素類生物質[1]。纖維素的基本結構單位是纖維二糖，由D-葡萄糖分子以β-1，4糖苷鍵組成的大分子多糖。由于纖維素結構簡單、含量豐富且具有可生物降解性的特點，如果能通過生物轉化技術把地球上的纖維素和半纖維素轉化成單糖，對于緩解世界能源危機及固體廢棄物資源化具有不可估量的價值[2]。

纖維素酶在轉化纖維素和半纖維素方面起著決定性的作用。自然界中能生產纖維素酶的微生物種類很多，但是大多數由于產纖維素酶能力低且酶系組分不完全，限制了其在工業上的應用。其中，里氏木霉由于產量高及其安全無毒性成為主要的纖維素酶生產菌株之一。從20世紀90年代初開始，國內外就開始利用里氏木霉產纖維素酶，并對產酶的工藝條件開始進行摸索。近年來，人類通過誘變選育、基因工程、原生質體融合等菌種選育方法，在纖維素酶的生產方面取得了較為突出的進展[3-5]。

1 里氏木霉及其纖維素酶

1.1 纖維素酶

纖維素酶是指降解纖維素的一組酶的總稱，其不是單個酶，而是起協同作用的多組分復合酶系。纖維素酶主要由3種酶組成：內切型-β-葡聚糖酶（EC3.2.1.4），外切型-β-葡聚糖酶（EC3.2.1.91，也稱纖維二糖水解酶）和纖維二糖酶（EC3.2.1.21，也稱β-葡萄糖苷酶）[6]。纖維素酶特異性高，反應條件簡單，降解過程中不會污染環境等，是將纖維素和半纖維素轉化成葡萄糖的關鍵。

纖維素酶和一般酶反應不一樣，其主要區別在于纖維素酶是多組分酶系。在水解纖維素為葡萄糖的過程中，必須依靠不同組分之間的協同作用才能完成。其作用機理如圖1所示[7]。大分子首先在內切葡聚糖酶的作用下產生新的游離末端，然后由外切葡聚糖酶在新產生的還原端或非還原外切纖維素鏈，生成纖維素二糖（或葡萄糖），再由β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖生成兩個葡萄糖。

圖1 纖維素酶作用機制Fig.1 Action mechanism of cellulose enzyme

目前，纖維素酶的產酶菌株的活力還不是很高，致使其生產成本過高，限制了其進一步的應用。所以，酶解成本過高是制約纖維素轉化為生物乙醇的主要障礙，其占總生產成本的比例很大，只有將酶的成本降低，生物乙醇才有可能與石油競爭。纖維素酶的生產是成功的酶促轉化纖維素生物質為生物乙醇的重要因素之一。因此，選育出高產纖維素酶且酶活性穩定的產酶菌株至關重要。

1.2 產纖維素酶的主要微生物

產纖維素酶的微生物包括真菌、細菌和放線菌。不同微生物生產的纖維素酶的各組分比例有著顯著差異，且降解纖維素的能力也各不相同。其中，雖然放線菌比真菌耐受高溫和酸堿，但由于生長繁殖慢且纖維素酶的產量低，研究較少[8]。另外，細菌的酶產量也不高，且以內切酶為主，大多數酶對結晶纖維素沒有活性，所生產的纖維素酶是胞內酶或吸附于細胞壁上，分離純化難度大，限制了其在工業上的應用。

而在絲狀真菌中，產酶活力較強的菌種為木霉屬（Trichoderma）、曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）和鐮孢菌屬（Fusarium）。其中最著名的是里氏木霉（Trichoderma reesei），其在生產纖維素酶方面具有很多優點[9]，如生長環境粗放，便于控制和培養；穩定性好，不易退化；產纖維素酶活力高；生產的纖維素酶為胞外酶，易于分離純化；且安全無毒，無污染。另外，里氏木霉生產的纖維素酶系各組分結構較為合理，包括5個內切酶EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ、EGⅣ和EGⅤ（60%～80%），兩個外切酶CBHⅠ、CBHⅡ（20%～36%）以及兩種β-葡萄糖苷酶BGⅠ和BGⅡ（1%），能更有效的水解轉化纖維素為葡萄糖。因此，里氏木霉被公認為是目前最具有工業應用價值的纖維素酶生產菌株。

1.3 里氏木霉的生產工藝

里氏木霉的生產工藝可以分為固態發酵和液態深層發酵。固態發酵是以小麥、甘蔗等農作物的秸桿為原料，類似于自然狀態下真菌的生長條件，其優點是纖維素酶系完全，有利于降解天然纖維素；投入成本低，操作工藝簡單。缺點是生產的纖維素酶很難提純，生產效率低，容易污染，勞動強度大，不適合大規模生產。史通等[10]對里氏木霉RUT-C30與黑曲霉NL02固態混合發酵產酶進行了研究，經過優化后β-葡萄糖苷酶活力達到132.45 IU/g。

液態深層發酵是在通氣攪拌式發酵罐中進行，里氏木霉在產酶過程中受到著多因素的影響，一般可以通過控制培養基中的營養成分比例、碳氮源、pH值、培養時間、溫度、含水量、誘導劑、表面活性劑及溶氧水平等因素進行優化。液態深層發酵的缺點是技術水平先進，難度大；投資設備大，成本高。優點是原料利用率高，產量好；發酵條件易于控制，不易污染；機械自動化程度高，可大規模生產；從而成為近年來研究的主要培養方式。據相關文獻報道，里氏木霉液態深層發酵生產的纖維素酶中濾紙酶活多數穩定在10 U/mL左右。王涫等[11]對里氏木霉FST-1的產酶培養基及條件進行優化，濾紙酶活力達到13.0 U/mL。張曉月等[12]研究了發酵培養基對里氏木酶RUT-C30產纖維素酶活力的影響，結果表明，濾紙酶活力達到9.13 IU/mL，較之前提高了72.26%。AHAMED A等[13]研究了機械攪拌對里氏木霉RUT-C30在發酵罐中生產纖維素酶活力的影響，研究結果表明，沒有機械攪拌產酶效果較好，濾紙酶活力（filter paper activity，FPA）達到17U/mL，羧甲基纖維素酶（carboxymethyl cellulase，CMCA）活力達到11.8 U/mL。

2 產纖維素酶里氏木霉菌株的選育

雖然里氏木霉生產的內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性較高，但也存在一些缺點，如生產的纖維素酶表現出較低的β-葡萄糖苷酶的活性，會導致纖維二糖的積累，而纖維二糖的積累對內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶具有很強的反饋抑制作用，從而導致纖維素的糖化效率不高[14]。為了克服里氏木霉的這些不足，提高纖維素酶的各組分酶活以及防止菌種退化，采用的適當菌種選育方法改良菌種的遺傳是很有必要的。常用的菌種選育方法有自然育種、誘變育種、基因工程育種、原生質體融合育種、纖維素酶的分子改造等。

2.1 自然育種

自然誘變是指對微生物細胞群體不經過人工處理而直接進行篩選的育種方法，是一種簡單易行的育種方法。缺點是微生物的自然突變率很低，難以提高菌株的產酶水平。李榮杰[15]從土壤中篩選出一株酶活較高的里氏木霉FYFJ928，其發酵水平經優化后可達到15.6 IU/mL。孫海彥等[16]從熱帶雨林土壤中分離纖維素酶高產菌，經鑒定為里氏木霉，其FPA活力達到5.8 U/mL，CMCA活力達到10.2 U/mL。AKINOLA G E等[17]從土壤中通過平板篩選出6株纖維素酶產量較高的木霉屬菌株，并對產酶條件進行了優化。結果表明，里氏木霉生產的纖維素酶濾紙酶活和β-葡萄糖苷酶活最高。

2.2 誘變育種

誘變育種是選育出高產纖維素酶突變菌株的一種簡單高效的方法，它能夠使菌株的突變頻率比自然突變提高幾百倍至幾千倍，從而大幅度改善菌種特性。優點是效果好、操作簡單、條件和設備要求較低。缺點是突變不定向，具有盲目性。誘變育種可分為物理誘變、化學誘變和復合交替誘變。

2.2.1 物理誘變

物理誘變常用的誘變劑種類很多。有非電離輻射類的紫外線、激光和離子束等，及能夠引起電離輻射的X射線、α射線、β射線、γ射線、快中子等[18]。

非電離輻射中紫外線由于其操作簡單、成本低、效果好等優點，是微生物育種中應用廣泛的有效誘變劑之一。傅力等[19]對里氏木霉DWC原生質體進行紫外誘變，得到突變菌株DWC5，其CMCA、FPA分別達到820.4 mg/（mL·h）和23.2 mg/（mL·h），為工業生產中提高纖維素的生物轉化率提供實驗依據。IKE M等[20]以里氏木霉ATCC66589為出發菌株，經紫外線誘變，獲得兩株突變菌株M2-1和M3-1，其濾紙酶活分別達到257 U和281 U。張素敏等[21]利用紫外線誘變里氏木霉T306，得到突變菌株的CMCA活力達到64.2 U/mL。

另外，低能離子注入法作為一種新型的生物誘變手段，具有損傷輕、突變率高、突變譜廣等優點。張寧等[22]利用氮離子注入技術對里氏木霉進行誘變選育，研究表明，在注入劑量為250×1014N+/cm2的條件下得到突變幅度較大菌株，獲得3株纖維素酶高產突變菌150-1、150-2、250-6，其平均酶活力較出發菌株增加了24.3%，建立了纖維素酶高產菌株的快速篩選方法，并為研究氮離子束的誘導機理提供依據。

電離輻射中，質子束照射與X射線、γ射線和電子束相比較，由于其局部高能量的特性已經成為一個新的突變方法。JUNG Y R等[23]質子數照射誘變里氏木霉KCTC6950，得到突變體菌株T-2（MT-2），其濾紙酶的活性增加了65%，CMCA活性增長了46%，β-葡萄糖苷酶的活性增加了213%。

2.2.2 化學誘變

在化學誘變劑中，主要有烷化劑、核酸堿基類似物和吖啶化合物。其中烷化劑可與巰基、氨基和羧基等直接反應，故更易誘發基因突變。最常用的烷化劑有亞硝基乙基脲烷（nitroso ethyl urea alkanes，NEU）、亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）、甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulfonate，EMS）、硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）等。DURAND H等[24]分別用亞硝基胍（NTG）、甲基磺酸乙酯（EMS）、亞硝酸鈉誘變里氏木霉QM9414，最終，在NTG的誘導下得到一株穩定性較好的突變菌株CL847，FPA酶活最高達到5.2 U/mL，較出發菌株提高了4倍。

2.2.3 復合交替誘變

單一誘變往往具有很多缺點，如突變不定向，效率低及易發生回復突變等。針對這一問題，很多學者把研究的熱點放到了復合交替誘變上。復合交替誘變是指利用兩種或兩種以上的誘變劑對微生物以復合交替處理的方式進行誘變。因不同誘變劑的作用機理不同，相應的對微生物的誘變效應也不相同。所以如果誘變劑搭配合理，復合交替誘變更易得到理想突變株。

GADGIL N J等[25]利用紫外線和亞硝酸鈉對里氏木霉QM9414進行復合交替誘變，突變株較出發菌株濾紙酶活提高至1.5倍，CMCA活力提高至1.8倍，β-葡萄糖苷酶活提高至1.06倍。HAO X C等[26]通過N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍和紫外線誘變得到突變菌株里氏木霉WX-112，并用響應面法優化產酶培養基，濾紙酶活提高至10.6 IU/mL。HE J等[27]利用N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍和紫外線兩種誘變劑先后誘導里氏木霉RUT-C30，得到突變菌株NU-6，其濾紙酶活、CMCA活力及β-葡萄糖苷酶活分別達到6.2 U/mL、54.2 U/mL、0.39 U/mL。張曉烜等[28]對里氏木霉40359進行紫外線、亞硝酸鈉、硫酸二乙酯誘變，得到一株穩定性較好的菌株YB40359，FPA酶活達到57.31 U/mL，提高了87.12%；CMCA活力達到142.60 U/mL，提高了58.66%。這些研究對里氏木霉高產纖維素酶菌株的選育及其工業化應用具有顯著意義。

2.3 基因工程育種

基因重組技術又稱為遺傳工程，是指在體外通過人工剪接，將不同來源的DNA分子組成一個雜合DNA分子（DNA分子重組體），然后導入宿主細胞去復制擴增或表達[29]。可以從不同產纖維素酶菌株中篩選出比活力高、酶學性質穩定的基因重組在一起并高效表達，具有定向性，是選育出高產纖維素酶菌株的有效途徑。表1列出了已成功在里氏木霉中克隆表達的基因。

表1 已成功在里氏木霉中克隆表達的基因Table 1 Successfully expressed gene in the cloning of Trichoderma reesei

2.4 原生質體融合育種

原生質體融合技術是指用自然或人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質體融合在一起，以期獲得兼有雙親遺傳性狀穩定的重組子。它具有雜交頻率高、重組體種類多及遺傳物質傳遞的更為完整等優點[35]，但它的遺傳穩定性還需要研究。里氏木霉具有較高的內切和外切葡聚糖酶活性，而黑曲霉有較高的β-葡萄糖苷酶活性，為了選育出更好的纖維素酶生產菌，可將里氏木霉和黑曲霉進行原生質體融合，篩選到具有這兩屬優點的融合子。EI-BONDKLY A M等[36]將木霉屬與黑曲霉通過原生質體融合技術融合。其中，里氏木霉NRRL 18670與黑曲霉NRRL 599融合獲得的融合子（1/5）濾紙酶活，CMCA、β-葡萄糖苷酶活相較于黑曲霉分別提高了200%、212.5%、66.7%。原生質體融合在獲得高產纖維素酶菌株方面具有廣闊的發展前景。

2.5 纖維素酶的分子改造

纖維素酶在很多領域廣泛應用，不同的行業由于目的不同所要求的酶學性質也不相同。如有些生物工藝要求纖維素酶耐高溫，而另外有些則要求纖維素酶耐堿性或耐酸性。而真菌生產的天然纖維素酶還不能滿足人們的實踐要求，因此對纖維素酶進行有目的的分子改造很有必要[37]。ZHANG J W等[38]對里氏木霉RUT C30的β-葡萄糖苷酶基因BGLⅠ進行改造，獲得3個轉化子B2、B12、B15，其中β-葡萄糖苷酶活力最高達到5.90 IU/mg，提高到出發菌株的3.7倍；濾紙酶活最高達到1.42 IU/mg，提高到出發菌株2.29倍。

3 應用和前景展望

目前，里氏木霉生產的纖維素酶在食品加工、釀造、飼料、醫藥、紡織、造紙工業等各個領域都有重要的用途[39]。在食品加工工業中[40]，用纖維素酶對農產品進行預處理相較于傳統的加熱蒸煮或酸堿處理有很多優點，如使植物組織膨化松軟，減少農產品香味和營養物質的損失，改善口感，更利于消化，節約處理時間等。另外，纖維素酶也應用于發酵和釀造等工業中。動物飼料中含有大量纖維素，而大部分飼養動物（除某些反芻動物以外）都不具有分解纖維素的能力，造成資源浪費及環境污染。纖維素酶一方面以添加劑的形式加入到動物飼料中；另一方面纖維素酶用于動物飼料的預處理，如秸稈或其他粗飼料。在醫藥領域中，用于中草藥有效成分的提取，中藥提取成分分析和治療某些疾病等。纖維素酶還在紡織和造紙工業中都有重要應用。

里氏木霉在生產纖維素酶具有非常廣闊的應用前景，但要獲得高效的纖維素酶生產菌株，還需要長時間的努力。從20世紀90年代初人們就開始對里氏木霉產纖維素酶進行研究，但是里氏木霉在生產纖維素酶方面還是具有很多缺點，如生產技術落后、規模小、生產成本高、酶活性低等，這極大地限制了其在工業上的應用。目前，可以通過誘變育種、基因重組、原生體融合技術、雜交育種、分子改造等各種行之有效的方法，以期提高纖維素酶的質量和產量，獲得纖維素酶高產菌。另外，可以選擇廉價的工業化原料為碳氮源，節約生產成本。隨著不斷深入的研究里氏木霉，以及高新技術的快速發展，獲得適合工業生產的高活力纖維素酶菌株的前景將是一片光明。

[1]石元春.中國生物質原料資源[J].中國工程科學，201l，13（2）：16-23.

[2]方志鋒，劉昆侖，陳復生，等.木質纖維素類生物質制備生物乙醇研究進展[J].現代化工，2013，33（1）：30-33.

[3]DE CASTRO A M,FERREIRA M C,DA CRUZ J C,et al.High-yield endoglucanase production byTrichoderma harzianumioc-3844 cultivated in pretreated sugarcane mill byproduct[J].Enzyme Res,2010,26:1-8.

[4]NEAGU D A,DESTAIN J,THONART P,et al.Trichoderma reeseicellulase produced by submerged versus solid state fermentations[J].Bull UASVM Agr,2012,69(2):320-326.

[5]JUHASZ T,SZENGYEL Z,SZIJARTO N,et al.Effect of pH on cellulase production ofTrichoderma reeseiRUT C30[J].Appl Biochem Biotechnol,2004,113-116:201-211.

[6]ZHANG Y H,HIMMEL M E,MIELENZ J R.Outlook for cellulose improvement:Screening and selection strategies[J].Biotechnol Adv,2006,24:452-481.

[7]劉樹立，王 華，王春艷，等.纖維素分子結構及作用機理的研究進展[J].食品科技，2007（7）：12-15.

[8]韓鴻鵬，張麗琴，郝青梅，等.放線菌產纖維素酶的化學修飾[J].安徽農業科學，2012，40（4）：2298-2300.

[9]KAWAI T,NAKAZAWA H,IDA N,et al.A comprehensive analysis of the effects of the main component enzymes of cellulase derived fromTrichoderma reeseionbiomass saccharification[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2013,40(8):805-810.

[10]史 通，宋向陽，歐陽嘉，等.黑曲霉與里氏木霉固態混合發酵產β-葡萄糖苷酶[J].生物加工過程，2013，11（5）：11-15.

[11]王 涫，王明鈺，穆子銘，等.里氏木霉纖維素酶生產工藝的優化[J].黑龍江農業科學，2012（5）：108-111.

[12]張曉月，孜力汗，李勇昊，等.里氏木霉RUT-C30 產纖維素酶培養基優化及酶解特性[J].過程工程學報2014，14（2）：312-317.

[13]AHAMED A,VERMETTE P.Effect of mechanical agitation on the production of cellulases byTrichoderma reeseiRUT-C30 in a draft-tube airlift bioreactor[J].Biochem Eng J,2010,49(3):379-387.

[14]DAI Z Y,ARYAL U K,SHUKLA A,et al.Impact ofalg3 gene deletion on growth,development,pigment production,protein secretion,and functions of recombinantTrichoderma reeseicellobiohydrolases inAspergillus niger[J].Fungal Genet Biol,2013,61:120-132.

[15]李榮杰.纖維素酶高產菌的分離篩選與培養基優化[J].畜牧與飼料科學，2009，30（6）：9-11.

[16]孫海彥，趙平娟，黎絹華，等.纖維素酶高產菌株的篩選及鑒定[J].安徽農業科學，2011，39（36）：22206-22208.

[17]AKINOLA G E,OLONILA O T,ADEBAYO-TAYO B C.Production of cellulases byTrichodermaspecies[J].Acad Arena,2012,4(12):27-37.

[18]周德慶.微生物學教程[M].北京：高等教育出版社，1993.

[19]傅 力，涂正東，葉 凱，等.里氏木霉高產纖維素酶菌株的選育及產酶培養基的優化[J].食品與機械，2009，25（3）：10-13.

[20]IKE M,PARK J Y,TABUSE M,et al.Cellulase production on glucose-based media by the UV-irradiated mutants ofTrichoderma reesei[J].Appl Microbiol Biotechnol,2010,87(6):2059-2066.

[21]張素敏，陳彩芳，葉云秀，等.內切葡聚糖苷酶高產菌株的誘變選育[J].微生物學通報，2013，40（8）：1448-1456.

[22]張 寧，蔣劍春，楊 靜，等.低能離子注入法誘變選育纖維素酶產生菌的研究[J].林產化學與工業，2012，32（5）：29-33.

[23]JUNG Y R,SHIN H Y,YOO H Y,et al.Production of cellulases andβ-glucosidase inTrichoderma reeseimutated by proton beem irradiation[J].Korean J Chem Eng,2012,29(7):925-930.

[24]DURAND H,CLANET M.Genetic improvement ofTrichoderma reeseifor large scale cellulase production[J].Enzyme Microb Tech,1988,10(6):341-346.

[25]GADGIL N J,DAGINAWALA H F,CHAKRABARTI T,et al.Enhanced cellulase production by a mutant ofTrichoderma reesei[J].Enzyme Microb Tech,1995,17(10):942-946.

[26]HAO X C,YU X B,YAN Z L.Optimization of the medium for the production of cellulase by the mutantTrichoderma reeseiWX-112 using response surface methodology[J].Food Technol Biotech,2006,44(1):89-94.

[27]HE J,YU B,ZHANG K Y,et al.Strain improvement ofTrichoderma reeseiRut C-30 for increased cellulase production[J].Indian J Microbiol,2009,49(2):188-195.

[28]張曉烜，王傲雪.飼用高產纖維素酶菌株的誘變選育[J].中國飼料，2011（13）：20-23.

[29]SONG J Z,LIU B D.Cloning of two cellobiohydrolase genes fromTrichoderma virideand heterogenous expression in yeastSaccharomyces cerevisiae[J].Mol Biol Rep,2010,37(4):2135-2140.

[30]王冰冰，夏黎明，杜風光.黑曲霉纖維二糖酶基因的克隆及其在里氏木霉中的表達[J].化工學報，2011，62（2）：452-457.

[31]MA L,ZHANG J,ZOU G,et al.Improvement of cellulase activity inTrichoderma reeseiby heterologous expression of a beta-glucosidase gene fromPenicillium decumbens[J].Enzyme Microb Tech,2011,49(4):366-371.

[32]金 欣，夏黎明.厭氧真菌內切-β-葡聚糖苷酶基因在里氏木霉中的重組與表達[J].高效化學工程學報，2011，25（4）：637-642.

[33]JIN X,XIA L M.Heterologous expression of an endo-β-1,4-glucanase gene from the anaerobic fungusOrpinomycesPC-2 inTrichoderma reesei[J].World J Microbiol Biotechnol,2011,27(12):2913-2920.

[34]顧斌濤，江守坤，夏黎明.中性內切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重組與表達[J].高校化學工程學報，2013，27（1）：108-112.

[35]張曉烜，李景富，王傲雪.里氏木霉40359 原生質體制備條件研究[J].東北農業大學學報，2011，42（8）：108-111.

[36]EL-BONDKLY A M.Gene transfer between differentTrichodermaspecies andAspergillus nigerthrough intergeneric protoplast fusion to convert ground rice straw to citric acid and cellulases[J].Appl Biochem Biotechnol,2006,135(2):117-132.

[37]FANG H,XIA L M.High activity cellulase production by recombinantTrichoderma reeseiZU-02 with the enhanced cellobiohydrolase production[J].Bioresource Technol,2013,144:693-697.

[38]ZHANG J W,ZHONG Y H,ZHAO X N,et al.Development of the cellulolytic fungusTrichoderma reeseistrainwith enhancedβ-glucosidase and filter paper activity using strong artificial cellobiohydrolase 1 promoter[J].Bioresource Technol,2010,101(24):9815-9818.

[39]王仁華，劉曉蘭，王琤韋華，等.水產動物纖維素酶的應用研究[J].飼料研究，2011（12）：62-64.

[40]李西騰.纖維素酶及其在發酵食品工業中的應用[J].江蘇調味副食品，2009，26（4）：33-41.