椰子水與菠蘿汁生產細菌纖維素的對比研究

李 斌，鐘春燕，王錫彬，王志國，向 東*

（1.海南大學 食品學院，海南 海口 570228；2.海南椰國食品有限公司，海南 海口 570311）

海南自1997年開始，利用豐富的椰子水資源作為培養基，以木醋桿菌（Acetobacter xylinum）為菌種生產細菌纖維素凝膠食品，商品名稱為椰纖果或椰子納塔，通常由菠蘿汁生產的納塔稱之為菠蘿納塔，由椰子水生產的納塔稱之為椰子納塔。海南目前主要以椰子水進行納塔生產，年生產能力將近30萬t，產值超過10億元，是近年來海南新興的食品工業的支柱產業。

關于細菌纖維素研究目前集中于基礎發酵方面，如通過誘變篩選高產菌株[1-2]、優化培養基配方[3-5]、發酵工藝的優化等[6-11]。采用非椰子水發酵生產細菌纖維素食品近年來也有報道[12-13]，但限于產業鏈區域分布的關系，均未形成產業化規模。海南地區利用椰子水生產細菌纖維素歷史接近20年，近年來隨著椰子原料的缺乏和價格上漲，逐步有納塔生產企業探索采用菠蘿汁、芒果汁生產細菌纖維素凝膠，但未進行深入的研究。本研究將椰子水和菠蘿汁作為主要原料，從前期發酵產酸、發酵周期以及細菌纖維素密度等方面進行了全面對比，對于利用非椰子水資源生產細菌纖維素凝膠具有重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

細菌纖維素凝膠生產菌：木醋桿菌（Acetobacter xylinum）HN001，海南大學食品綜合實驗室保藏；椰子水、菠蘿汁前期發酵產酸菌：木醋桿菌（Acetobacter xylinium）YG002，海南椰國食品有限公司保藏。

硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉等均為分析純：上海國藥集團；生化試劑蛋白胨：上海生工公司。

椰子水：取自海口本地市售的新鮮椰子；菠蘿汁：由海口本地市售的新鮮菠蘿打漿過濾獲得。

1.1.2 培養基

菌株HN001、YG002種子液培養基：新鮮椰子水70 mL，硫酸銨0.1 g，硫酸鎂0.1 g，磷酸二氫鉀0.1 g，蔗糖4.0 g，蛋白胨0.1 g，蒸餾水30 mL，pH值自然，100 ℃滅菌5 min。細菌纖維素凝膠生產培養基：

（1）椰子水培養基：發酵椰子水50 mL，硫酸銨0.1 g，硫酸鎂0.1 g，磷酸二氫鉀0.1 g，蔗糖3.0 g，蒸餾水50 mL，用NaOH調節pH值至4.1，100 ℃滅菌5 min。

（2）菠蘿汁培養基：發酵菠蘿汁50 mL，硫酸銨0.1 g，硫酸鎂0.1 g，磷酸二氫鉀0.1 g，蔗糖3.0 g，蒸餾水50 mL，用NaOH調節pH值至4.1，100 ℃滅菌5 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；YX280A手提式不銹鋼蒸汽消毒器：上海三申醫療器械有限公司；SHP-1500生化培養箱：上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 前期發酵產酸

無論是椰子水還是菠蘿汁，新鮮的果汁用于生產細菌纖維素效果較差，這是因為其中缺乏木醋桿菌產細菌纖維素所需的有機酸、微生物菌體等重要營養基質，不同有機酸對木醋桿菌產纖維素的影響也不盡相同[14]。鑒于有機酸對木醋桿菌產纖維素的重要影響，必須對椰子水、菠蘿汁進行前期發酵才能作為細菌纖維素的培養基質使用，前期發酵液的酸度對于后續發酵生產細菌纖維素凝膠具有重要的參考意義，將酸度作為前期發酵的主要指標進行測定，酸度越高表明前期發酵效果越佳。目前椰子納塔工業化生產前主要采用自然發酵的方式，這種發酵方式操作簡單，產酸量高，但由于自然感染的未知微生物，不能保證食品安全性和產品質量穩定性；菠蘿汁與椰子水在成分上有較大差異（如還原糖、微量元素含量等），采用自然發酵的方式往往不能獲得滿意的結果，本研究菠蘿汁前發酵采用接種產酸菌種進行發酵，旨在和現有的納塔生產前期發酵工藝進行比較。

椰子水前期產酸：模擬目前椰子納塔的生產工藝，剖開新鮮椰子，取椰子水，自然放置暴露于空氣中進行自然發酵，采用GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的方法每天測定發酵椰子水的總酸含量[15]。

菠蘿汁前期產酸：將新鮮的菠蘿汁滅菌后接種木醋桿菌（Acetobacter xylinum）YG002，進行前期產酸發酵，采用GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的方法每天測定發酵菠蘿汁的總酸含量。

將椰子水和菠蘿汁前期產酸發酵的色澤、氣味、總酸量進行對照。

1.3.2 細菌纖維素凝膠發酵生產周期的對比

按1.3.1所述前期發酵方法，將發酵的椰子水及發酵的菠蘿汁按照1.1.2配制培養基，置于250 mL燒杯中，滅菌后接種木醋桿菌（Acetobacter xylinum）HN001靜置培養。根據納塔生產企業的標準規格，選擇細菌纖維素凝膠厚度1.2 cm作為標準規格，比較細菌纖維素凝膠厚度達到1.2 cm時的發酵生產周期。

1.3.3 不同培養基對細菌纖維素凝膠纖維密度的影響

木醋桿菌在液體培養基中發酵獲得的細菌纖維素凝膠是纖維素和水結合的狀態，其基本結構是：納米級別直徑的細菌纖維束形成立體網絡的骨架，網絡間的孔隙充滿水分，通常纖維素干質量占細菌纖維素凝膠總質量（濕質量）的1%以下，而水分質量往往超過99%。本研究對細菌纖維素凝膠密度作如下定義：單位體積內細菌纖維素凝膠（水合狀態）的纖維素干質量。引入細菌纖維素凝膠密度及測定纖維素密度值，可以直接表征細菌纖維素在水合狀態下的分布疏密情況。

按1.3.1所述前期發酵方法，將發酵的椰子水及發酵的菠蘿汁按照1.1.2配制培養基，置于250 mL燒杯中，滅菌后接種5%（V/V）木醋桿菌（Acetobacter xylinum）HN001靜置培養2～6 d，每天測定細菌纖維素凝膠的干質量及水合狀態下的體積，計算纖維素密度。

細菌纖維素凝膠干質量（m）的測定：將細菌纖維素凝膠用蒸餾水洗滌3次后、置于80 ℃干燥至質量恒定，稱質量。

細菌纖維素凝膠體積（v）的測定：取出按上述方法進行培養的細菌纖維素凝膠膜，用半干的濕布拭去其表面多余的水分，放入裝有植物油的1 000 mL量筒中，根據量筒排出油的體積測定細菌纖維素凝膠的體積。細菌纖維素凝膠密度的計算公式如下：

式中：ρ為細菌纖維素密度，kg/m3；m為細菌纖維素干質量，kg；v為細菌纖維素凝膠體積，m3。

2 結果與分析

2.1 不同培養基發酵產酸分析

表1 椰子水隨發酵時間的變化Table 1 Change of coconut water with fermentation time

將新鮮的椰子水暴露于空氣中，由于椰子水中感染了空氣中的微生物，這些微生物代謝后產生了大量的酸，新鮮的椰子水隨發酵時間的增加產生了較大變化，結果見表1所示。由表1可知，椰子水顏色逐步由澄清透明變成乳白色，氣味由椰子水原有的清香味變成具有較濃酸味，總酸隨發酵時間的延長有顯著增加，但發酵8 d后總酸增加量開始延緩。

將新鮮的菠蘿汁經滅菌后接入前期產酸發酵菌種木醋桿菌（Acetobacter xylinum）YG002進行發酵，接種量5%（V/V）。新鮮的菠蘿汁隨發酵時間的增加產生了較大變化，結果見表2所示。由表2可知，菠蘿汁顏色變化不大，氣味由菠蘿汁原有的濃郁香味變成具有較濃酸味，總酸初始量較高，隨發酵時間的延長有顯著增加，但發酵3 d后總酸增加量開始延緩，發酵至5 d后產酸量不再增加，菠蘿汁發酵后總酸量大于椰子水產酸量。

表2 菠蘿汁隨發酵時間的變化Table 2 Change of pineapple juice with fermentation time

2.2 細菌纖維素凝膠生產周期的對比

根據納塔生產企業產品的一般規格，選擇細菌纖維素凝膠厚度為1.2 cm時，采用椰子水培養基采用自然發酵10 d主要培養基質，菠蘿汁培養基采用前期發酵5 d作為主要培養基質，接種5%（V/V）木醋桿菌（Acetobacter xylinum）HN001靜置培養，比較2種培養基發酵細菌纖維素凝膠生產周期，結果如圖1所示。

圖1 不同培養基生產周期對比Fig.1 Comparison of production period with different culture mediums

由圖1可知，椰子水培養基細菌纖維素凝膠厚度生長到≥1.2 cm時需要7 d，這個生產周期與目前椰子納塔生產企業的生產周期一致。而以菠蘿汁作為培養基生長到同等厚度則只需要5 d，比通常的椰子納塔生產周期縮短了2 d。這可能是因為菠蘿汁在接種木醋桿菌（Acetobacter xylinum）YG002后發酵后，其發酵液中的有機酸、微生物菌體等能夠促進木醋桿菌（Acetobacter xylinum）HN001快速代謝產生細菌纖維素，而自然發酵的椰子水其中雖然也含有較多有機酸，但不能加速HN001代謝產生細菌纖維素。

2.3 不同培養基細菌纖維素凝膠纖維素密度的對比

將椰子水發酵10 d，菠蘿汁發酵5 d，獲得最大產酸量后，按照1.3.2所述的方法進行細菌纖維素凝膠的培養，第2天至第6天每天測定細菌纖維素凝膠的干質量及體積，計算纖維素密度。不同培養基細菌纖維素的密度與發酵時間的關系如圖2所示。

圖2 不同培養基纖維素密度的對比Fig.2 Comparison of cellulose density with different culture mediums

由圖2可知，椰子水細菌纖維素的纖維素密度始終大于菠蘿汁細菌纖維素的密度，表明以發酵的椰子水為主要原料生產細菌纖維素時形成的凝膠更為致密，以手按壓，感覺椰子水培養基生產的細菌纖維素凝膠質地較硬，而菠蘿汁培養基生產的細菌纖維素凝膠質地偏軟。這說明以發酵的椰子水作為培養基，可能更適合木醋桿菌的增殖，能夠形成更高的菌體密度，因此在菌株代謝產纖維素時單位體積獲得了更高的產量。而菠蘿汁經發酵后，具有更高的酸度，能夠促進木醋桿菌迅速代謝細菌纖維素，但過高的酸度反而可能會抑制產木醋桿菌的增殖，最終導致菌體密度較低，所形成的細菌纖維素密度也較椰子水培養基低。

在同等體積下，細菌纖維素凝膠總質量（濕質量）的變化取決于纖維素干質量的變化，但由于纖維素干質量占細菌纖維素凝膠總質量的比例較低（通常1%以下），直接測定其濕質量的變化來表征細菌纖維素產量存在較大的測量誤差。農業標準NY/T 1522—2007《椰子產品椰纖果》對細菌纖維素凝膠中的粗纖維的含量（質量百分比）作出了規定[16]，但這一指標無法直觀表征纖維素在細菌纖維素凝膠水合狀態下的分布情況。通過對不同培養基下細菌纖維素凝膠密度的變化研究，不僅可以獲得微生物產纖維素的分布信息，同時對納塔產品出現的質構變化可以作出合理解釋，如纖維素密度高的納塔產品質地較硬，而纖維素密度低的納塔產品質地偏軟等。

3 結論

海南自1997年開始，利用豐富的椰子水資源作為培養基，以木醋桿菌為菌種生產細菌纖維素凝膠，隨著椰子加工產業規模日漸增長，本省的椰子水資源已逐步不能滿足生產需要。利用豐富的熱帶水果資源，特別是價值低廉的殘次果資源，作為培養基生產細菌纖維素是解決椰子水資源不足的研究方向。

本研究利用熱帶水果資源菠蘿汁作為生產培養基，與傳統的椰子水培養基進行了對比研究，結果表明，利用菠蘿汁生產細菌纖維素具有一定的優勢，如前期發酵酸度較高，能夠加速木醋桿菌分泌產生細菌纖維素，從而獲得較短的生產周期。此外，利用固定的菌種進行前期產酸發酵替代自然發酵對于納塔生產的質量穩定性、食品安全性，以及較高的酸度對于防止后續發酵生產過程中的雜菌污染，都具有一定的優勢。利用菠蘿汁作為培養基，其在增殖木醋桿菌菌體方面弱于椰子水，從而導致產品纖維素密度較低，這對于最終產品的品質可能會有一定影響，如何克服這一劣勢，是今后利用非椰子水資源生產細菌纖維素需要解決的問題之一。

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