銀川市市售食品中單增李斯特菌污染狀況分析研究

烏日娜，劉 翔，郭邦成，閆立群，張玉平

(1.北方民族大學生命科學與工程學院，寧夏銀川 750021;2.寧夏自治區疾病預防控制中心，寧夏銀川 750004)

單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，LM，單增李斯特菌)是一種重要的極具威脅的食源性病原菌。該菌在環境中無處不在，主要通過食物傳播［1］。肉類、蛋類、禽類、海產品、乳制品、蔬菜等都已被證實是李斯特菌的感染源，很多國家都已經采取措施來控制食品中的李斯特菌，并制定了相應的標準。李斯特菌病是經進食被單增李斯特菌污染的食物而引起的一種嚴重的食源性疾病，易感人群包括老年人、孕婦、新生兒和免疫功能障礙者，該病的致死率高達30% ～70%［2］。國內外各地食源性致病菌監測結果表明，食品中單增李斯特菌的污染普遍存在，受污染的食物種類繁多，涉及生肉類、動物水產品、熟肉制品、速凍米面食品、蔬菜等食品，極有可能導致李斯特菌病和構成潛在流行的威脅［3］。鑒于此，積極進行全國范圍內食品中單增李斯特菌的污染狀況研究十分必要。不同地區使用抗生素種類不同，導致了當地致病菌的耐藥種類和特性也必然不同。研究各地區食品中單增李斯特菌的耐藥特性，對于李斯特菌病的預防和治療意義重大。目前，對于寧夏銀川市食源性單增李斯特菌的耐藥情況還尚未見研究報道，筆者對銀川市市售食品中單增李斯特菌的污染情況、血清型和抗生素敏感性進行分析，以期能為預防控制食源性單增李斯特菌的爆發流行、追蹤溯源和臨床用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源。2012年10月至2013年9月期間在銀川市3個區(金鳳區、西夏區和興慶區)的農貿市場和超市進行取樣，每個區選取2家農貿市場和1家超市，其中每個農貿市場選取2個攤位。嚴格按照取樣計劃，每月采集樣品60份，樣品共計720份，包括生羊肉(145份)、生牛肉(145份)、生豬肉(120份)、生雞肉(120份)、動物性水產品(70份)和速凍米面制品(120份)。其中肉類采樣包括常溫、冷鮮和冷凍貯藏樣品。

1.1.2 試驗菌株。標準菌株:單增李斯特菌ATCC19112，購自中國醫學細菌保藏中心;藥敏質控菌株:金黃色葡萄球菌ATCC25923，大腸埃希氏菌ATCC2922，由寧夏自治區疾病預防控制中心提供。

1.1.3 主要試劑與培養基。單增李斯特菌用LB1、LB2增菌液，北京陸橋技術有限責任公司;PALCAM瓊脂基礎及添加劑、單增李斯特菌顯色培養基、TSA-YE、木糖及鼠李糖發酵管、SIM動力培養基，均購自青島海博生物技術有限公司;MH血瓊脂平板CP0220A，廣東環凱微生物科技有限公司;抗生素藥敏紙片，QXOID英國公司;API Listeria生化鑒定條，生物梅里埃公司。

1.1.4 主要儀器設備。麥氏比濁儀，法國梅里埃生物公司;電熱恒溫培養箱，南京試驗儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 單增李斯特菌分離鑒定方法。按照2012年《國家食源性疾病監測網工作手冊》［4］，同時參考GB4789.30-2010《單核細胞增生性李斯特氏菌檢驗》［5］進行樣品的分離和菌株鑒定。

1.2.2 血清分型試驗方法。按照單增李斯特菌血清使用說明書，用單增李斯特菌血清，通過玻片凝集法(O抗原)和試管凝集法(H抗原)進行血清分型。

1.2.3 藥敏試驗方法?？股胤N類參照美國國家臨床實驗室標準委員會推薦的單增李斯特菌藥敏試驗抗生素選擇原則和臨床治療常用抗生素確定。共選擇21種抗生素:慶大霉素(CN)、亞胺培南(IMP)、氯霉素(C)、多粘菌素(PB)、頭孢噻吩(KF)、頭孢噻肟(CTX)、鏈霉素(S)、復方新諾明(SXT)、諾氟沙星(NOR)、利福平(RD)、四環素(TE)、紅霉素(E)、氨芐西林/舒巴坦(SAM)、強力霉素(DO)、氨芐西林(AMP)、左氧氟沙星(LEV)、新生霉素(N)、青霉素(P)、呋喃妥因(F)、環丙沙星(CIP)、萬古霉素(VA)。藥敏結果判定標準按照NCCLs手冊2005版。藥敏試驗采用世界衛生組織(WHO)及美國臨床標準委員會(NCCLS)推薦的K-B紙片擴散法進行。

1.2.4 數據統計分析。試驗數據采用spss13.0軟件統計分析。

2 結果與分析

2.1 各類食品中單增李斯特菌的污染情況 銀川市各類食品中單增李斯特菌污染情況見表1。由表1可知，720份食品中檢出單增李斯45株，總檢出率為6.25%，其中污染率最高的是生雞肉(8.33%)，其次為生豬肉和速凍米面制品(7.50%)，之后依次為動物性水產品(5.71%)、生牛肉(4.83%)和生羊肉(3.45%)。不同食品中單增李斯特菌檢出率無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 不同季度食品中單增李斯特菌的污染情況比較 對4個季度食品中單增李斯特菌的檢出率進行統計，具體情況見表2。4個季度中第3季度檢出率最高，為13.89%;其次為第2季度，檢出率為6.67%;第4季度檢出率最低，為0.56%。各季度單增李斯特菌檢出率有顯著性差異(P＜0.01)。

表1 各類食品中單增李斯特菌的檢出率

表2 各季度食品中單增李斯特菌的檢出率

2.3 不同貯藏溫度食品中單增李斯特菌的檢出情況 除了速凍米面制品外，所檢測的生肉類和動物性水產品共計600份樣品，均包括常溫、冷鮮和冷凍貯藏樣品。常溫樣品反映了當地實際氣候的溫度，冷鮮肉溫度控制在-4℃。生豬肉沒有采集冷凍樣品，動物性水產品均為冷鮮或冷凍貯藏。結果表明，3種貯藏溫度中冷鮮樣品中單增李斯特菌檢出率最高，為10.77%，冷凍次之(5.56%)，常溫肉品檢出率最低(3.50%)，不同儲存條件有顯著性差異(P＜0.05)。從具體的食品種類來看，各類食品在不同貯藏溫度下單增李斯特菌的污染情況不同，具體見表3。

表3 不同貯藏溫度各類食品中單增李斯特菌的檢出率

由表3可知，對于生牛肉和生羊肉樣品，常溫和冷鮮均未檢出單增李斯特菌，僅冷凍樣品有，檢出率均為7.06%，且二者在所有冷凍樣品中單增李斯特菌的檢出率較高。冷鮮肉品中冷鮮雞肉單增李斯特菌檢出率最高(25.00%)，動物性水產品和生豬肉的檢出率均為10.00%。常溫樣品中生豬肉檢出率最高(6.25%)，其次是生雞肉(5.00%)。

2.4 超市和農貿市場食品中單增李斯特菌的檢出情況比較 農貿市場采集生肉樣共計270份，檢出單增李斯特菌的陽性樣本有10個，檢出率為3.70%;超市采集生肉樣330份，檢出單增李斯特菌26個，檢出率達7.88%。不同來源市售肉品中單增李斯特菌的檢出率有顯著性差異(P＜0.05，χ2=4.590，P=0.032)。

2.5 單增李斯特菌血清學分型結果 45株食源性單增李斯特菌共分為5 個血清型(1/2a、1/2b、1/2c、4b 和 4a)，1/2a 型為主要血清型，占 46.67%(21/45);其次為 1/2c型(44.44%，20/45)、1/2b(2.22%，1/45)、4b(2.22%，1/45)、4a(4.44%，2/45)。5種血清型中1/2a型分布最廣，在所有種類樣品中均有檢出，1/2c型僅在熟肉制品中未檢出，致病性較強的4b型分離自生雞肉中，1株1/2b型分離自速凍米面制品。

2.6 單增李斯特菌藥敏試驗結果 45株單增李斯特菌進行21種抗生素的藥敏試驗，結果表明，有37株單增李斯特菌對7種抗生素存在耐藥，總耐藥率為82.22%(37/45)，其中耐多粘菌素就有35個，耐藥率為77.78%(35/45)，其次是頭孢噻肟、四環素、呋喃妥因、青霉素、紅霉素和頭孢噻吩，耐藥率分別為 28.89%(13/45)、13.33%(6/45)、4.44%(2/45)、4.44%(2/45)、4.44%(2/45)和 2.22%(1/45);鏈霉素、強力霉素和氯霉素藥敏處于中介，中介率分別為11.11%(5/45)、6.67%(3/45)和4.44%(2/45)。對諾氟沙星、利福平、氨芐西林/舒巴坦、環丙沙星、復方新諾明、氨芐西林、左氧氟沙星、慶大霉素、新生霉素、萬古霉素和亞胺培南全部敏感。37株耐藥菌株中，單一耐藥的菌株有18株，其中耐多粘菌素有16株，雙重耐藥10株，三重耐藥8株，四重耐藥1株。

3 討論

近年來，國內外的研究人員紛紛對不同食品中的單增李斯特菌污染狀況進行了研究。全球各地食品中均有不同程度的單增李斯特菌污染，其中生肉中單增李斯特菌的污染情況最嚴重［6-13］。該研究結果顯示，生雞肉中單增李斯特菌檢出率最高，為8.33%;其次是生豬肉和速凍米面制品;動物性水產品、生牛肉和生羊肉中檢出率較低。這提示生肉類是該地區重點食品衛生監測種類，尤其是雞肉、豬肉和速凍米面制品。生牛肉和生牛羊肉中單增李斯特菌的污染情況最輕，檢出率比一些研究報道均低［14-15］，其原因除了寧夏清真牛羊肉衛生質量管理因素之外，還與清真牛羊肉獨特的屠宰加工方式有一定關系。

該研究對4個季度食品中單增李斯特菌污染結果分析可知，污染情況最嚴重的是第3季度，該季度也是一年中溫度最高的季度，接近單增李斯特菌的最適生長溫度，一旦食品被其污染大量繁殖后，出現食品間交叉污染的幾率更大，故檢出率最高。低溫對許多致病菌的生長具有抑制作用，但單增李斯特菌卻可耐受低溫，低溫環境下可以生長，故在溫度較低的第1季度和第4季度仍可檢出單增李斯特菌。

該研究對不同貯藏溫度下生肉中單增李斯特菌污染情況做了調查，冷鮮肉品中單增李斯特菌檢出率最高，為10.77%，冷凍次之(5.56%)，常溫肉品檢出率最低(3.50%)。其中常溫生牛肉和生羊肉未檢出單增李斯特菌。結果表明，最令人們放心的冷鮮肉單增李斯特菌的污染程度最高，其衛生安全很不樂觀，同時傳統意義上較為安全的冷凍肉中單增李斯特菌的污染程度也較高，這是因為此致病菌對低溫有較強的耐受性，使得冷凍食品在冰箱中交叉污染的機會增加，提醒人們購買冷凍食品應充分加熱后再食用。該研究發現，雖然在常溫和冷鮮生牛羊肉中未檢出單增李斯特菌，但冷凍牛羊肉制品如冷凍牛羊肉卷、牛羊肉片的單增李斯特菌檢出率卻較高，其原因可能是在冷凍牛羊肉制品生產和貯藏過程與其他食品交叉污染，或是加工設備本身帶菌造成的，提示在冷凍肉制品加工過程中及時清洗相關設備，避免交叉污染的可能性。同時也提示消費者在涮牛羊肉或是爆炒時注意延長時間，達到充分殺菌的目的。

該研究對不同來源生肉和動物性水產品中單增李斯特菌的檢出率進行統計，結果顯示，超市來源肉品中單增李斯特菌檢出率較高，這說明超市肉品的衛生質量狀況不容樂觀，存在嚴重的安全隱患，提示相關部門應加強超市的衛生管理。

銀川市45株單增李斯特菌共分為5種血清型，其中1/2a和1/2c型是主要的血清型，該結果與其他相關研究報道基本一致［16-17］。此外，對于致病力強的1/2b型在速凍米面制品中檢出，4b型在生雞肉中檢出，且都是耐藥菌株，1/2b型對多粘菌素耐藥，4b型對多粘菌素和頭孢噻肟雙重耐藥。提示人們應針對相關食品進行重點監督和監測工作，防止交叉污染或烹調不當導致食物中毒的發生。

耐藥性試驗結果顯示，45株單增李斯特菌有37株耐藥，耐藥率為82.22%，與我國其他地區相比，耐藥情況嚴重，遠高于其他地區的水平［16-18］。所耐受的7種抗生素中，耐多粘菌素最嚴重，這也是導致寧夏單增李斯特菌菌株整體耐藥率與沒有檢測該抗生素的地區相比較高的主要原因。銀川市單增李斯特菌與其他地區的菌株一樣對四環素、頭孢類抗生素和紅霉素均產生一定的耐藥性，但對臨床一線藥物氨基青霉素、氨基糖苷類和喹諾酮類均未出現耐藥情況。生豬肉和生雞肉中的單增李斯特菌耐藥情況最嚴重，這與哈爾濱市［14］的情況一樣，而寧夏人民喜食的牛羊肉中單增李斯特菌的耐藥情況較為樂觀，尤其是生羊肉中單增李斯特菌的耐藥率最低，且都是單一耐藥。

該研究及國內外單增李斯特菌的污染狀況調查報告提示人們應高度重視該致病菌，健全食品監測網，及時發現和掌握我國食源性致病菌污染程度和污染分布特點，積極加強致病菌耐藥性監測，獲得當地菌株的耐藥信息，提高食源性疾病的預警與控制能力。

［1］BUCHANAN R L，LINDQVIST R，ROSS T，et al.Risk assessment of Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods［C］.Geneva，Switzerland:Food and Agriculture Organization of the United Nations，2004:26.

［2］MEAD P S，SLUTSKER L，DIETZ V，et al.Food-related illness and death in the United States［J］.Emerg Infect Dis，1999，5:607-625.

［3］YUCEL N，CITAK S，ONDER M.Prevalence and antibiotic resistance of Listeria species in meat products in Ankara，Turkey［J］.Food Microbiol，2005，22(2):241-245.

［4］國家食品安全風險評估中心.2012年食源性致病菌監測工作手冊［K］.2012:213-215.

［5］中華人民共和國衛生部.GB 4789.30-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗［S］.北京:中國標準出版社，2010.

［6］MANZANO MARISA，COCOLIN LUCA，CANTONI CARLO.Temperature gradient gel electrophoresis of the amplified product of a small 16S rRNA gene fragment for the identification of Listeria species isolated from food［J］.J Food Protect，2000，63(5):659-661.

［7］OSAILI T M，ALABOUDI A R，NESIAR E A.Prevalence of Listeria spp.and antibiotic susceptibility of Listeria monocytogenes isolated from raw chicken and ready-to-eat chicken products in Jordan［J］.Food Control，2011，22(3/4):586-590.

［8］陳敏，王穎.上海市食品中李斯特氏菌污染情況調查［J］.海預防醫學雜志，2001，13(3):112-113.

［9］韓喜榮，謝利軍，韓曄，等.海淀區2002～2006年食源性致病菌監測分析［J］.現代預防醫學，2009，36(2):333-334.

［10］李毅.溫州地區五類致病菌的調查分析［D］.杭州:浙江大學，2010.

［11］薛超波，戴意飛，王萍亞，等.舟山市6類食品中單增李斯特菌污染情況監測［J］.海峽預防醫學雜志，2010，16(3):52-53.

［12］何樹森，楊小蓉，蘭真，等.四川省食品中重要食源性病原菌污染監測與分析［J］.現代預防醫學，2007，34(20):3810-3813.

［13］權玉玲，蘇誠玉，張元國，等.甘肅省部分地區各類食品中單增李斯特菌污染情況調查分析［J］.中國衛生檢驗雜志，2009，19(9):2150-2151.

［14］徐本錦，李新平，王新，等.陜西楊凌區市售食品中單增李斯特菌污染狀況的調查與分析［J］.西北農林科技大學學報:自然科學版，2012，40(10):129-134.

［15］尹錄，杜艷芬，赫明雷，等.哈爾濱市鮮肉中單核細胞增生性李斯特菌的分離鑒定及耐藥性分析［J］.中國預防獸醫學報，2009(12):929-932.

［16］閆鶴，王彬，師寶忠，等.單核細胞增生李斯特菌血清型、耐藥性研究［J］.中國抗生素雜志，2010，35(10):774-778.

［17］賈靜.山東省食品中單核細胞增生性李斯特菌耐藥性與分子分型研究［D］.濟南:山東大學，2012.

［18］王紅，張正東，陳海燕，等.自貢市食品中單核細胞增生李斯特菌污染狀況的調查及藥敏結果分析［J］.現代預防醫學，2008，35(23):4679-4681.