磺酸基修飾SBA—15在MALDI—TOF—MS氨基酸分析中的應用

趙興隆 吳學

摘 要：磺酸基化學修飾的介孔材料SBA-15被用做無機基質，用于MALDI-TOF-MS分析幾種人體必需氨基酸。在優化的分析條件下，磺酸基修飾的SBA-15對氨基酸的檢出限達到pmol級別。混合氨基酸樣品被成功檢測。

關鍵詞：SBA-15；MALDI-TOF-MS；必需氨基酸

基質輔助激光解吸電離技術MALDI，是21世紀80年代發展起來的一種應用于質譜分析的電離化技術。它被成功應用于生物大分子的分析領域。然而由于使用了有機基質，在小分子量區域產生了碎片干擾。為了解決這一問題，質譜學界做了大量的嘗試和研究[1]。近年來出現了一些將表面化學修飾的介孔材料SBA-15用于MALDI無機基質的報道[2]。

氨基酸是重要的生物小分子，其中8種必需氨基酸，是一些疾病的標志物，對它們的分析檢測具有很大的應用價值[3]。MALDI-TOF-MS分析具有簡單、快速的優點。本研究擬采用磺酸基修飾的SBA-15，用作無機基質，分析幾種必須氨基酸。

實驗部分

1 儀器與試劑

MALDI-TOF-MS基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀（島津公司）；三氟乙酸，3-巰基丙基三甲氧基硅烷，溶劑，氨基酸（分析純，希恩思公司）；SBA-15（南京先鋒納米科技公司）。

2 SBA-15的化學修飾

SBA-15，在馬弗爐中550℃下焙燒2h，接著與3倍質量的MPTMS，在精制甲苯中回流48h。過濾，用乙醇索氏提取24h。真空干燥24h，得到SBA-15-SH。稱量100mg的SBA-15-SH，加入10mL質量比為1/3/10的雙氧水、甲醇和水溶液中，室溫下攪拌12h，過濾。濾餅加入到5mL 0.5mol/L的H2SO4溶液中，室溫下攪拌12h，過濾。用乙醇和水洗滌，抽濾，得到SBA-15-SO3H[3]。真空干燥12h，取出，置于干燥器中保存。

用FT-IR進行定性分析。FT-IR結果表明，在嫁接巰基后，在2850～2980cm-1范圍內出現其伸縮振動峰。同時，在2580cm-1處出現一個弱的S-H吸收峰。磺化后，2580cm-1處的吸收峰消失。

3 分析條件的優化

3.1 基質，樣品，與酸比例的優化

將苯丙氨酸，纈氨酸，TFA配制成3*10-4mol/L的甲醇溶液。將SBA-15-SO3H配制成0.06、0.6、6mg/mL的甲醇分散液。樣品/酸/基質各取5μL混合，震蕩。從中移取1μL，點樣。自然干燥后，進入MADLI-TOF-MS進行分析。譜條件為：正離子反射模式，能量120，100個信號累加。在10-4mol/L濃度下，纈氨酸與苯丙氨酸都能夠很好的被檢測到。我們考察了在樣品與酸的濃度一定時，基質的量對信號強度的影響，實驗結果如下：Phe，磺化SBA-15的ρ=0.02mg/mL，信號強度為5.5K；ρ=0.2mg/mL，強度為11K；ρ=2mg/mL，強度為11.5K。Val，ρ=0.02mg/mL，強度為3K；ρ=0.2mg/mL，強度為6K；ρ=2mg/mL，強度為6.5K。可見，樣品一定，SBA-15-SO3H的量的增加使信號強度增加。但當基質濃度達到0.2mg/mL以后，增加的較不明顯，考慮到隨著SBA-15-SO3H的量的增加，可能會帶來少量的碎片的干擾。我們最終選擇比例為10-4mol氨基酸/0.2g磺基化SBA-15。

此外，我們考察了酸的濃度對信號強度的影響，經過類似的信號強度對比試驗，我們最終選擇了10-3mol/L為優化的條件，即三氟乙酸的濃度為樣品的10倍。

3.2 溶劑的優化

MALDI-TOF-MS分析存在一個問題，就是重現性較差，而這與溶劑的分散能力有關。所以我們考察了三種常用的溶劑，甲醇，乙腈，水。將苯丙氨酸，纈氨酸分別配制成3*10-4mol/L的甲醇，乙腈，水溶液。在優化比例下進行分析，質譜條件同上。每個樣品要點樣三次，每個樣品點分析兩次。分析后計算RSD值/%如下：Phe/甲醇，29；Phe/乙腈，27；Phe/水，21；Val/甲醇，31；Val/乙腈，26；Val/水，18。水中的重現性最好，這可能是由于磺化的SBA-15在水中的分散能力提高造成的。

4 檢出限的研究

將苯丙氨酸，纈氨酸，分別配制成3*10-4、3*10-5、3*10-6、3*10-7mol/L的水溶液。優化條件下，進入MADLI-TOF-MS進行分析。當樣品濃度為10-6mol/L時，以SBA-15-SO3H為基質能夠順利檢出，[Val+Na]+、[Phe+H]+的S/N分別為32，53。

圖1 pmol樣品的MALDI-TOF-MS譜圖。質譜條件同上。a）纈氨酸，b）苯丙氨酸。

5 混合樣品的分析

將5種氨基酸，配制成濃度均為10-4Mmol/L的混合水溶液。在優化條件下，進入MADLI-TOF-MS進行分析。結果如圖2，得到了各自區分的信號。

圖2混合樣品的MALDI-TOF-MS譜圖。m/z：纈氨酸117，蘇氨酸119，異亮氨酸131，甲硫氨酸149，苯丙氨酸165。

6 結束語

本研究將磺酸基化學修飾的SBA-15，用作MALDI-TOF-MS的無機基質，分析了幾種人體必需氨基酸。我們優化了分析條件，并實現了對混合樣品的分析。由于磺酸基的存在，修飾的SBA-15作為基質的檢出限得到了降低，并且在水做溶劑的條件下，具有較好的重現性，適用于對生物小分子進行分析。

參考文獻

[1]張森，倪 ，李樹奇，孔祥蕾.適用小分子化合物分析的基質研究[J].化學進展，2014，26（1）：158-166.

[2]王小生.必需氨基酸對人體健康的影響[J].中國食物與營養，2005，7：48-49.

[3]袁興東，沈健，李國輝，周敬來，金知晚，樸尚顏.表面含磺酸基的介孔分子篩催化劑SBA-15-SO3H的制備及其催化性能[J].高等學校化學學報，2002，23（12）：2332-2335.