MBR系統CANON工藝的快速啟動及微生物種群特征

李 冬,何永平,張肖靜,梁瑜海,張玉龍,范 丹(.北京工業大學水質科學與水環境恢復工程北京市重點實驗室,北京 004；.哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 50090)

MBR系統CANON工藝的快速啟動及微生物種群特征

李 冬1*,何永平1,張肖靜2,梁瑜海1,張玉龍1,范 丹1(1.北京工業大學水質科學與水環境恢復工程北京市重點實驗室,北京 100124；2.哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150090)

為了考察CANON工藝的快速啟動策略及功能微生物的種群特征,在常溫MBR反應器內接種普通活性污泥后間歇運行.啟動策略為以調控曝氣時間和曝氣量作為主要方法,首先在限氧條件下啟動亞硝化,之后進一步降低DO啟動CANON工藝.在CANON工藝啟動成功后,通過調整曝氣時間和無機碳源濃度提高了總氮去除負荷,并采用PCR-DGGE技術分析了穩定運行的CANON工藝內功能微生物的種群特征.結果表明,CANON工藝經36d成功啟動,NH4+-N去除率和總氮去除率最終穩定在99%和84%左右,氮去除負荷達到0.41kg/(m3·d).DGGE測序結果表明,Nitrosomonas和Candidatus Kuenenia stuttgartiensis是反應器內的優勢菌種,兩種微生物協同作用,共同在MBR內完成了高效的自養脫氮.

MBR；普通活性污泥；CANON；啟動；PCR-DGGE；微生物

基于亞硝化的全程自養脫氮(CANON)工藝具有脫氮效率高、耗氧量低、無需外加碳源且污泥產量低、經濟環保等優點,是近年來受到廣泛關注的一種新型生物脫氮工藝.在CANON工藝中,氨氧化菌(AOB)在限氧條件下,以氧作為電子受體將部分NH4+-N氧化為NO2--N,厭氧氨氧化(Anammox)菌以AOB產生的NO2--N為電子受體,與剩余NH4+-N反應,生成N2并釋放,達到脫氮目的.

現階段對CANON工藝的研究多在生物濾柱[1]或SBR[2-3]中進行.但生物濾柱多采用火山巖等硬性填料,造成其堵塞問題一直無法有效解決,而SBR污泥易流失,導致生物量減少,去除負荷低,且由于AOB和Anammox菌均是自養菌,生長緩慢,尤其是Anammox菌,倍增時間為11d[4],導致CANON工藝啟動時間長.因此尋找合適的反應器類型對CANON工藝的啟動及穩定運行意義重大.膜生物反應器(MBR)依靠膜滲透原理,將所有微生物截留在反應器內部,可防止污泥流失,提高反應器內生物濃度,特別適用于AOB菌和Anammox菌這類生長緩慢,倍增時間長的微生物生長.因此,若將MBR應用于CANON工藝可以有效解決污泥流失,處理負荷低等問題,從而加快啟動時間.

目前,國內外關于CANON工藝的接種污泥多采用具有亞硝化或厭氧氨氧化活性的特種污泥[5-8],而這些污泥相對稀缺,不易獲得且價格昂貴,相比之下普通活性污泥分布廣泛,容易得到且價格低廉.可見,若能以普通活性污泥為種泥來啟動CANON,可以說是為該工藝的啟動提供了既方便又經濟的污泥源.

因此,本研究在常溫條件下,接種普通活性污泥,采用MBR反應器,以間歇運行方式啟動CANON,同時通過PCR-DGGE、克隆等分子生物學技術研究反應器內功能微生物的種群特征,以期為縮短CANON工藝的啟動時間和微生物特性提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

試驗裝置采用有機玻璃制成的圓柱形MBR反應器,如圖1所示.圓柱內徑13cm,高度40cm,有效容積3L,內置聚偏氟乙烯(PVDF)中空纖維膜組件,膜孔徑為0.1μm,有效膜面積為0.2m2,膜通量36L/h.反應器底部設置曝氣環,采用鼓風曝氣,曝氣量由轉子流量計控制,中間設有攪拌機,用于基質和O2均勻擴散,外部設置水浴套筒,由溫度控制儀控制反應器內溫度.

1.2 接種污泥

試驗接種污泥取自北京市某污水處理廠普通活性污泥.接種前,污泥先經自來水和蒸餾水各清洗3遍,去除其中的雜質,之后接種至MBR反應器內.接種時MLSS為12.9g/L,MLVSS為10.6g/L,接種量為1L.

圖1 試驗裝置示意Fig.1 Schematic of the experimental reactor

1.3 試驗用水與試驗方法

試驗用水采用人工配水,分別以(NH4)2SO4和NaHCO3作為NH4+-N和堿度的來源,NH4+-N濃度和堿度固定不變.進水中額外添加MgSO4·5H2O、CaCl2、KH2PO4和營養液Ⅰ、Ⅱ作為營養物質,營養液Ⅰ包括EDTA 5000mg/L和FeSO45000mg/L．營養液Ⅱ(mg/L)包括EDTA 15000、ZnSO4·7H2O 430、CoCl2·6H2O 240、MnCl2·4H2O 990、CuSO4·5H2O 250、Na2MoO4· 2H2O 220、NiCl2·6H2O 190、Na2SeO4·10H2O 210和H3BO414.試驗用水水質見表1.

表1 試驗用水水質Table 1 Key water quality of the influent

試驗在常溫下(23～25℃)采用間歇運行方式,每個周期包括:瞬時進水,曝氣反應,曝氣完成后,膜抽吸出水.換水比83.3%,一個周期完成后進入下一個周期.CANON工藝的啟動采用先啟動亞硝化富集AOB,再限氧富集Anammox,啟動CANON.試驗主要分為3個階段:階段Ⅰ,亞硝化啟動;階段Ⅱ, CANON工藝啟動;階段Ⅲ,CANON工藝負荷提高.不同階段主要運行條件見表2.

表2 不同階段主要運行條件Table 2 Operation conditions at different stages

1.4 分析項目與方法

NH4+-N、NO2--N、NO3--N、MLSS、MLVSS等指標均采用國家規定的標準方法測定[9]; NO2--N積累率(NAR)可按式(1)計算;DO、pH值及溫度測定分別采用EUTECH DO2000PPG多功能溶解氧在線測定儀,WTW pH296 型在線測定儀.

式中:[NO2--N]eff為出水NO2--N濃度; [NO3--N]eff為出水NO3--N濃度.

1.5 DNA提取,PCR-DGGE,克隆和測序

1.5.1 基因組DNA的提取 在CANON工藝的穩定期,從MBR反應器內采集混合液.用UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)提取基因組DNA,具體操作按說明書進行.所提取的基因組DNA用0.8wt%(質量分數)的瓊脂糖凝膠電泳檢測,以備PCR用.

1.5.2 PCR擴增及DGGE電泳 采用巢式PCR方法,分別擴增β-proteobacteria菌門的AOB, Planctomycetales菌門的Anammox菌.為擴增AOB的16S rDNA,第一輪擴增使用CTO189fA/B和CTO189fC混合引物(體積比2:1)作為正向引物,反向引物采用CTO654r.之后以第一輪PCR擴增產物為模板,使用通用引物對F338(帶GC夾)/R518,進行第二輪PCR擴增.對于Anammox菌的特異性片段的擴增,第一輪先以引物對Pla46F/630R進行浮霉球菌擴增.之后以第一輪PCR擴增產物為模板,使用引物對Amx368f(帶GC夾)/Amx820r,進行第二輪PCR擴增.PCR 反應體系為25μL,其中包含2.5μL 10×Ex Taq buffer (Mg2+Plus ),2.0μL DNTP,1.0μL BSA,1.0μL引物,0.125μL, TaKaRa Ex Taq酶,模板DNA約1.0ng,用無菌水補齊至25μL.引物堿基序列及反應條件見表3.

表3 PCR常用引物對應程序Table 3 Corresponding programs of commonly used PCR primers

PCR擴增產物用1.5wt%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測.采用Sanprep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)進行PCR 產物的純化回收,具體操作按說明書進行.對PCR產物進行DGGE 分析:聚丙烯酰胺質量分數8wt%,變性梯度為30%～60%,電壓120V,電泳時間5h,電泳在Dcode Universal MutationDetection System儀器上進行.電泳結束后按Bassam等[14]的方法對凝膠進行銀染,并對凝膠拍照.

1.5.3 克隆和測序 切取DGGE 圖譜中的目的條帶溶于150μL T E(pH 8.0)溶液中,4℃過夜,以此為模板,以不含GC夾的引物進行PCR擴增,并對PCR 產物進行純化.按照pMD19-T plasmid vector system說明書進行基因片段與載體的連接后,轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中,通過藍白斑法篩選陽性克隆子,過夜培養后并進行測序.采用BLAST對測序結果和基因庫中已知序列進行相似性分析.并將所獲得的序列提交至Gentbank,授權序列號為:KF171345～KF171352 (AOB),KF442618～KF442619(Anammox).

2 結果與討論

2.1 亞硝化的啟動及穩定運行

亞硝化的實現是成功啟動CANON的基礎,該階段的目的是富集AOB并抑制NOB的活性.此階段,以限氧方式啟動亞硝化,初始進水NH4+-N濃度為200mg/L,曝氣量為0.3L/min, DO為0.3mg/L, 曝氣時間為5h.由圖2可見,在第1d,反應器內就有NO2--N積累,這說明在限氧反應器內,NOB的活性就已經受到抑制,不能及時氧化NO2--N,從而造成了NO2--N積累,NAR在30%左右.在前6d, NAR整體呈上升趨勢,第6d NAR達到50%左右,認為亞硝化啟動成功.但是在第5d,第6d, NH4+-N去除率(ARR)有所波動且較低,所以第7d曝氣時間由原來的5h延長為7h,使更多的NH4+-N被氧化,提高ARR.曝氣時間延長后,DO為0.3mg/L,ARR提高并持續上升,到第25d達到70%左右,此后至第30d穩定在75%左右.NAR也一直升高,最終穩定在90%左右,總氮去除率(TNR)維持在2%(總氮損失造成).因為啟動亞硝化的目的是為了啟動CANON,因此NAR無需上升并穩定在95%以上.而且,ARR也沒有必要達到100%,反應器內留有NH4+-N既可以抑制NOB[15]還可以為Anammox菌快速提供基質.

亞硝化快速啟動并穩定運行的主要原因是:①DO控制得當.AOB氧飽和常數為(0.2～0.4)mg/L,NOB 為(1.2～1.5)mg/L[16],本研究中DO控制在0.3mg/L,有效的抑制了NOB的活性.②殘留NH4+-N的影響.反應器內一直殘留部分NH4+-N,也可以抑制NOB的活性.從而使AOB快速富集,成功啟動了亞硝化.

圖2 階段Ⅰ反應器運行性能Fig.2 Performance of the reactor during stageⅠ

2.2 CANON工藝的啟動及穩定運行

反應器運行至第31d,降低DO,啟動CANON.曝氣量由0.3L/min下降到0.2L/min, DO為0.15～0.2mg/L,曝氣時間延長為9h.從圖3可知,此階段ARR在經過3d的平緩期后持續上升并穩定在80%左右,NAR下降并穩定在73%左右,反應器內開始出現明顯的總氮損失現象,TNR和氮去除負荷(NRR)最高分別為35%和0.22kg/(m3·d).由圖3可知,出水NO2--N濃度急劇下降,而出水NO3--N濃度增長卻較緩慢,說明減少的NO2--N并沒有全部被NOB氧化為NO3--N,并且出水NH4+-N濃度不斷減小,推測反應器內發生了厭氧氨氧化反應,Anammox菌將NH4+-N和NO2--N轉化為少量NO3--N和N2,導致出水NH4+-N和NO2--N濃度同時下降,出水NO3--N濃度輕微上升.此外,總氮開始有損失,TNR不斷上升,而配水中不含有機物,總氮損失不可能是由反硝化細菌造成的,并且ΔNO3--N/ΔNH4+-N已接近于0.11,更進一步論證了反應器內發生了Anammox反應,建立了CANON工藝.同時2.4節中DGGE圖譜結果也證實此階段AOB菌和Anammox菌共存于反應器內.降低DO后,僅經過1d就出現了氮去除現象,說明前期活性污泥中含有Anammox菌,之所以沒有表現活性,是受外界條件(基質、DO等)和自身的影響.Strous等[17]的研究表明Anammox菌細胞濃度>1010～1011個/mL時活性才能顯現出來.本研究中,調節DO后,Anammox菌立即顯現出來.同時ARR和TNR在31～34d較后面幾天增勢緩慢,說明CANON啟動初期,Anammox菌活性較低,隨著反應的進行,Anammox菌逐漸適應,后期活性不斷提高.在第36d時,NRR達到0.1kg/(m3·d)以上,認為CANON工藝啟動成功,圖中顯示,本研究在常溫下僅經歷36d就完成了MBR內CANON工藝的啟動.相比于國內外其他研究,本研究僅接種普通活性污泥,就能在短時間成功啟動CANON,說明利用MBR反應器可以縮短CANON工藝的啟動時間(表4).

CANON工藝快速啟動的原因分析如下:①反應器內較低的DO,在保證AOB需氧量的前提下,低DO會有效抑制NOB,并且對Anammox菌的影響較小,有利于富集AOB和Anammox菌;②較高的NH4+-N濃度有利于AOB和Anammox菌的生長,同時亞硝化啟動后,殘存的NH4+-N及生成的NO2--N也會誘導Anammox菌的活性;③由于膜的抽吸作用,使膜絲表面附著少量活性污泥逐漸形成泥餅層且由于氧傳質限制,在泥餅層內部會形成局部缺氧微環境,有利于Anammox菌的生長繁殖;④因MBR反應器能有效的進行固液分離,將全部污泥截留在反應器內,沒有污泥流失,從而使反應器內微生物數量不斷增多,特別適用于AOB和Anammox菌的生長繁殖.這一點是其他反應器不具備的,也是最關鍵的一點.

圖3 階段Ⅱ反應器運行性能Fig.3 Performance of the reactor during stage Ⅱ

2.3 CANON工藝負荷提高

階段Ⅲ為CANON工藝負荷提高階段.階段Ⅱ完成后,NH4+-N和NO2--N還有一定量的剩余,為進一步降低出水NH4+-N濃度,提高TNR,將曝氣時間延長為10h.從圖4可以看出,ARR和TNR迅速上升,直至第55d分別為99.78%和69.04%,這說明延長曝氣時間,能夠使更多的NH4+-N被氧化,同時Anammox菌活性也沒有受到抑制.此時出水中NH4+-N濃度幾乎為0,但還殘留NO2--N,說明Anammox菌活性有待提高. Yang等[22]通過研究證明在厭氧氨氧化工藝中添加足夠的無機碳濃度可以提高NRR.為此將堿度由1600提高到2000mg/L,并將曝氣時間縮短至9h,減少AOB氧化NH4+-N的量,提高Anammox菌的活性.之后出水NH4+-N濃度雖有短暫升高但后來一直降低, 第59d再次降低到0左右并維持穩定.出水NO2--N呈下降趨勢,最終接近0.第56至76d,ARR和TNR分別穩定在99%、84%左右, ΔNO3--N/ΔNH4+-N及ΔNO3--N/ΔTN分別穩定在0.12和0.14,接近于0.11和0.127[23].氮去除負荷最高可達0.41kg/(m3·d),平均氮去除負荷為0.38kg/(m3·d).表明MBR反應器內高效穩定的CANON工藝已經實現.

表4 CANON反應器啟動時間總結Table 4 Summary of the start-up time for CANON reactors

圖4 階段Ⅲ反應器運行性能Fig.4 Performance of the reactor during stage Ⅲ

2.4 DGGE分析

圖5 CANON工藝穩定期AOB和Anammox的DGGE圖譜Fig.5 DGGE profiles of AOB and Anammox in stable phase of CANON process

由圖5(a)可見,AOB有8個條帶(1～8),說明反應器內AOB種類還是較多的.對這8條主要條帶進行切割、溶解、回收、擴增,通過對DNA序列測序分析表明所有的AOB均屬于βproteobacteria(表5),它們與Nitrosomonas的相似度都在97%及以上,表明Nitrosomonas是反應器內的優勢菌種,且較穩定,這與Thomas F. Ducey等[24]的研究是一致的.并且Liu等[6]認為Nitrosomonas相對于Nitrosospira更適于在CANON反應器中生長,而Liu等[25]也發現Nitrosomonas是許多水生態系統中最常見的氨氧化菌類型.

圖5(b)顯示, Anammox有2個條帶,均屬于Planctomycetia(表5),其中條帶9與Candidatus Kuenenia stuttgartiensis的相似度高達99%,條帶10與anaerobic ammonium-oχidizing planctomycete的相似度也高達99%,這與Jing[26]等的研究結果是一致的.研究表明Candidatus Kuenenia stuttgartiensis是一種存在于淡水環境中的Anammox[27],而且在污水脫氮系統中常見[28]. DGGE圖譜顯示,本研究中Nitrosomonas和Candidatus Kuenenia stuttgartiensis 是CANON反應器內的優勢菌種,共同完成脫氮過程.

表5 DGGE條帶上AOB和Anammox的DNA序列比對結果Table 5 Results of sequence allignment between DNA sequences of AOB and Anammox from DGGE band

3 結論

3.1 首先,在限氧條件下啟動亞硝化,控制DO為0.3mg/L,經過6d,NO2--N積累率達到50%左右,亞硝化啟動成功.之后,降低DO至0.15～0.2mg/L,由亞硝化階段向CANON工藝轉變,經歷36d實現了MBR內CANON工藝的快速啟動.

3.2 通過調整曝氣時間和添加無機碳源提高氮去除負荷,經過76d,氮去除負荷最高可達0.41kg/(m3·d),平均氮去除負荷為0.38kg/(m3·d).實現了MBR內CANON工藝的高效穩定運行.

3.3 DGGE圖譜顯示在CANON工藝穩定期, Nitrosomonas和Candidatus Kuenenia stuttgartiensis是反應器內的優勢菌種,共同完成脫氮過程.

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The fast start-up of CANON process in MBR system and the characterization of microbes.

LI Dong1*, HE Yong-ping1, ZHANG Xiao-jing2, LIANG Yu-hai1, ZHANG Yu-long1, FAN Dan1(1.Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environment Recovery Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China；2.State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China). China Environmental Science, 2014,34(11)：2788～2795

To investigate the fast start-up of CANON process and characterization of functional microbes, conventional activated sludge was inoculated to an MBR and the reactor was operated intermediately at ambient temperature. In the launch strategy, the regulation of aeration and aeration time was used as the main method. First, partial nitrification was applied under oxygen-limited condition. Secondly, DO had to be decreased further to achieve CANON process. Finally, aeration time and inorganic carbon concentration needed to be adjusted to improve the total nitrogen removal rate. Besides, the characterization of functional microbes in stable CANON process was analyzed using PCR-DGGE techniques. The results showed that the CANON process launched successfully after 36 days, the ammonium removal rate and total nitrogen removal rate were kept at around 99% and 84% and the maxinum nitrogen removal rate can reach 0.41kg/(m3·d). DGGE profiles showed Nitrosomonas and Candidatus Kuenenia stuttgartiensis were predominant microbes in the reactor and they worked synergetically to form an efficient autotrophic nitrogen removal process within the MBR.

MBR；conventional activated sludge；CANON；start-up；PCR-DGGE；microbes

X172

A

1000-6923(2014)11-2788-08

李 冬(1976-),女,遼寧丹東人,教授,博士,主要從事水質科學與水環境恢復關鍵技術研究.發表論文100余篇.

2014-01-22

國家自然科學基金(51222807);國家重大科技專項水專項(2012ZX07202-005)

* 責任作者, 教授, lidong2006@bjut.edu.cn