低濃度鼠李糖脂單糖脂在近中性溶液中的聚集行為

談 菲,劉智峰,鐘 華,曾光明,袁興中 (湖南大學環境科學與工程學院;環境生物與控制教育部重點實驗室,長沙 410082)

低濃度鼠李糖脂單糖脂在近中性溶液中的聚集行為

談 菲,劉智峰,鐘 華*,曾光明,袁興中 (湖南大學環境科學與工程學院;環境生物與控制教育部重點實驗室,長沙 410082)

研究了臨界膠束濃度(CMC)附近鼠李糖脂單糖脂在近中性溶液中的聚集體粒徑分布.結果發現,單鼠李糖脂在低于CMC和高于CMC時均能形成聚集體,根據粒徑大小分為粒徑在5000nm左右的大粒子、200～500nm的中等粒子和40nm左右的小粒子.當pH≤7且濃度低于CMC時,中等粒子的粒徑隨單鼠李糖脂濃度增大而減小,且聚集體在分布上由大粒子向小粒子轉變.隨著pH值升高,中等粒子的粒徑也同樣由大變小,且分布上大粒子和中等粒子均向小粒子轉變.該結果被認為是聚集體中的單鼠李糖脂分子密度和分子的離解性質隨濃度或pH變化所致.

單鼠李糖脂；聚集體；臨界膠束濃度；離解

生物表面活性劑是一種具有親水和親油性的兩親性分子,具有增溶、分散、潤濕、滲透特性.鼠李糖脂是銅綠假單胞菌的次級代謝產物,具有表面活性劑的通性,在液相環境中濃度增加能發生聚集.由于生物表面活性劑具有良好的環境友好性及生物可利用性,在越來越多的生活和工業(如材料、生命、制藥等)領域得到應用研究[1-4].

在濃度和溶液pH值變化時,生物表面活性劑所形成的聚集體的結構也會發生變化.Imura等[5]發現在高濃度時,隨濃度繼續升高,甘露糖赤藻糖醇脂依次形成海綿晶格、雙連續立方晶格和膜結構.Ishigami等[6]研究了鼠李糖脂單糖脂和二糖脂在水或磷酸緩沖液中的聚集行為,結果發現在pH 4.3～5.8時,其聚集物主要以雙層膜的膠囊(Vesicle)形式存在于液相中;當pH值升高至6.0～6.5,溶液中出現了鼠李糖脂分子的雙層膜結構(Lamella),并伴隨有脂狀顆粒物的存在;隨著溶液pH值升高至6.8以上,聚集物發生了有膜結構和脂狀顆粒物向膠束(Micelle)的轉化.Champion等[7]用冷場透射電鏡進一步確定了在不同pH值的水溶液中60mmol/L鼠李糖脂聚集物的原始形態,并發現了隨著pH值的升高,聚集物依次發生了雙層膜或管狀結構、大型雙層膜或單層膜膠囊、小型單層膜膠囊以及膠束的轉化.

以上關于鼠李糖脂在溶液中聚集形態的研究集中在較高的鼠李糖脂濃度范圍內(均高于CMC),而對CMC附近的鼠李糖脂的聚集行為鮮有涉及.而鼠李糖脂作為一種高效的表面活性劑,在CMC附近即表現出較強的表面活性,Zhang等[8]研究表明,濃度低于CMC的鼠李糖脂單糖脂對烴類就表現出了較強的增溶作用.另一方面鼠李糖脂相對于一般的化學表面活性劑生產成本要高,使其在低濃度下發揮作用可提高其應用潛力,彌補生產成本高的不足.鼠李糖脂屬于陰離子表面活性劑,不同pH值下鼠李糖脂的離解度不同,前人研究[9]表明即使在適合微生物生長的中性pH值附近,pH值的變化也可能顯著影響鼠李糖脂在水溶液中的形態.因此,在近中性pH環境中濃度在CMC附近鼠李糖脂聚集行為的研究對它在有機污染生物修復中的應用具有實際意義.基于此,本文針對鼠李糖脂中重要的一類——鼠李糖脂單糖脂(簡稱“單鼠李糖脂”)在無機鹽溶液中的聚集行為進行了研究,考察了近中性pH條件下(6～8),濃度在CMC附近單鼠李糖脂的聚集體粒徑差異,以求進一步揭示低濃度鼠李糖脂的聚集行為.

1 材料與方法

1.1 試劑

本研究采用的生物表面活性劑為單鼠李糖脂,采用Zhong等[10]的方法制得,主要成分為RhaC10C10、RhaC10C12-H2和RhaC10C12(物質的量比0.80:0.08:0.12).實驗用純水由Lanconco Water Pro PS純水機(Kansas, USA)制取,電阻率18.2M?·cm.其他試劑均為分析純.

1.2 單鼠李糖脂CMC的測定

作為背景溶液的MSM溶液成分包括NaNO3(0.20%), KH2PO4(0.15%), Na2HPO4·12H2O (0.15%), MgSO4(0.01%), FeSO4·7H2O (0.001%).

稱取一定量的膏狀單鼠李糖脂溶解至MSM溶液中,并用MSM稀釋成不同濃度的單鼠李糖脂溶液,溶液的表面張力采用界面張力儀(JZ-200A,承德儀器廠)之Du Noüy環法于30℃下進行測定.在單鼠李糖脂濃度0～70μmol/L范圍內表面張力測定的靈敏度<2μmol/L,并且連續3次測定誤差在±0.1mN/m之內.通過溶液表面張力與單鼠李糖脂濃度之間的關系曲線得到該生物表面活性劑在MSM中的CMC.

1.3 單鼠李糖脂粒徑測定

通過微量注射器用20%的NaOH將不同濃度的單鼠李糖脂MSM溶液的pH值調至8.0.將溶液通過0.22μm的微孔濾膜(Millex-HV系列,Millipore Products, Billerica, Ma., U.S.)過濾,以除去溶液中灰塵等大顆粒雜質.濾液在帶有紙蓋的小燒杯中靜置2h使其中的單鼠李糖脂聚集體重新達到分配平衡,然后測定聚集體的粒徑分布.據以往類似實驗結果,在pH 8.0時溶液中單鼠李糖脂聚集體的粒徑遠小于0.22μm(后面的實驗結果也證實了這一點),因此可以認為過濾對單鼠李糖脂聚集體沒有截留.之后用微孔濾膜過濾后的20% HNO3溶液通過微升級移液槍逐步調節單鼠李糖脂的pH值至各目標值,在每個目標值下,溶液靜置2h使單鼠李糖脂聚集體重新達到分配平衡后,進行粒徑測定.由于硝酸濃度很高,加入硝酸溶液的體積相對于單鼠李糖脂溶液體積可忽略不計,故認為調節時單鼠李糖脂濃度不變.粒徑測定儀器為Zetasizer Nano ZEN3600 (Malvern Instruments, Malvern, U.K.)微粒粒徑測定儀.測定基于溶液微小粒子的動態光散射原理,其激光源為633nm的He-Ne激光燈,工作功率4.0mW.樣品由邊長約1mm的DTS-0012四棱柱聚苯乙烯樣品池盛裝,樣品池插入恒溫測樣室中30℃下進行測定,散射光于與光路呈173°角處由接收器收集.粒子粒徑通過累計量法進行計算,最終數據由儀器自帶軟件在SOP模式下分析獲得.最終得到的粒子粒徑為體積平均粒徑,各類粒子所占百分比為體積百分比.

2 結果與討論

2.1 單鼠李糖脂溶液CMC

表面活性劑的臨界膠束濃度CMC是指溶液中表面活性劑分子開始大量形成膠束時的表面活性劑濃度[11].當表面活性劑的濃度高于CMC時,溶液中的表面活性劑分子由于疏水基的范德華力作用將會發生聚集,形成親水基在表面、疏水基在核心的膠束結構,使溶液系統的能量達到最低狀態.在溶液和空氣的相界面生物表面活性劑分子也達到飽和,增加其濃度不會使溶液的表面張力繼續降低.在單鼠李糖脂濃度低于CMC時,溶液表面張力γst(mN/m)和濃度C(μmol/L)的對數值符合線性關系γst=b-alnC;當單鼠李糖脂濃度高于CMC時,溶液表面張力和液相濃度的關系用常數方程γst=γst0表示,其中γst0通過表面張力數據的標準方差最小化計算得到[12].

由圖1可見,在單鼠李糖脂濃度低于CMC時隨濃度升高,溶液的表面張力急劇下降,直至單鼠李糖脂濃度降低至CMC時,表面張力將不再隨單鼠李糖脂濃度變化,維持在一個穩定值.低于CMC和高于CMC時,溶液表面張力γst和單鼠李糖脂濃度C之間的關系分別為γst=69.8-7.379lnC (C≤70μmol/L)和γst=35.4 (C≥80μmol/L),聯立上述兩個方程得出單鼠李糖脂的CMC為75μmol/L,這與之前Mata-Sandovala等[13]的研究結果一致.

圖1 MSM溶液中鼠李糖脂濃度與表面張力之間關系Fig.1 Relationship between surface tenstion and concentration of monorhamnolipid in MSM

2.2 單鼠李糖脂在MSM溶液中的粒徑分布

由圖2可見,不同pH值和濃度下單鼠李糖脂可以是1個、2個或3個粒徑范圍的聚集體.通過對Zetasizer Nano ZEN3600儀器軟件對圖線的積分分析,可以得到每類聚集體的平均粒徑及其體積占所有粒子總體積的百分比.

單鼠李糖脂在MSM中的聚集體可能的形態共有3種,分別粒徑5000nm左右的大粒子c、粒徑200～500nm的中等粒子b和粒徑40nm左右的小粒子a,且即使在濃度低于CMC (75μmol/L)時也檢測到了聚集體的存在.由圖3可見,在各pH值下,隨著單鼠李糖脂濃度的增加,大粒子c粒徑保持5000nm左右沒有明顯變化,中等粒子b在濃度低于CMC時隨濃度的增加粒徑減小,在高于CMC時基本不變.除了pH=6.0的情況,小粒子a的粒徑隨濃度沒有明顯變化(左圖).對于粒子的分布,在某一pH值下,隨著濃度的增加,一般地有大粒子c和中等粒子b的體積百分比減小,而小粒子a的體積百分比增加(右圖).由于分子中羧基的存在, 單鼠李糖脂屬陰離子表面活性劑,在水溶液中能夠離解,它在常溫下的離解平衡常數Ka=10-5.6[6],在實驗pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0時,單鼠李糖脂在MSM中的離解度分別為71.5%, 88.8%, 96.2%, 98.8%,和99.6%.不考慮無機鹽等其他因素的影響,在固定pH下,單鼠李糖脂的離解度是一定的,其粒徑的變化由濃度的變化引起.隨著濃度的升高,粒子的粒徑減小,粒子表面單位面積單鼠李糖脂分子密度增加,同時小粒子的數目增加,這對于系統的熱力學穩定性有利.

圖2 不同pH和濃度條件下單鼠李糖脂在MSM溶液中的聚集體體積頻度分布Fig.2 Size volume distribution of monorhamnolipid aggregates under different conditions of pH and rhamnolipid concentration

圖3 單鼠李糖脂在不同pH值的MSM溶液中的聚集體粒徑及體積分布Fig.3 Size of co-aggregates and volume distribution in MSM of monorhamnolipid with different pH

由于單鼠李糖脂的離解度受溶液pH值的影響較大,pH值對單糖脂聚集體的粒徑分布有較大影響.各濃度下,大粒子c的體積百分比基本隨pH值的增加而降低,至pH 8.0時完全消失;中等粒子b的體積百分比基本隨pH值的增加而降低,在pH 6.5至pH 7.0段降低迅速,并且在pH7.5時完全消失;小粒子a的體積百分比隨pH值的增大而增加,直至pH8.0時聚集體完全以小粒子形式存在(右圖).隨著MSM溶液pH值的增大,溶液中離子態的單鼠李糖脂比例增加,聚集體表面單鼠李糖脂分子之間的靜電斥力增大,使得膠團曲率變大,粒徑變小,同時也促進了大粒子向小粒子的轉化.因此,隨著pH的增加,單糖脂的粒子b的粒徑在各濃度下都有減小的一般規律,同時大粒子和中等粒子向小粒子轉化.Champion等研究表明,在高濃度(60mmol/L)的單鼠李糖脂溶液中,隨pH值從6.0增大到8.0,其聚集形態發生了由大型雙層膜膠囊、大型單層膜膠囊、小型單層膜膠囊直至膠束的變化[14].而本研究顯示,在低濃度下(CMC左右),隨著pH值的增加其聚集形態也發生了由大到小的變化,與之一致.

以上結果表明,對于生物表面活性劑鼠李糖脂單糖脂,在其濃度低于CMC時溶液中形成了多種粒徑的聚集體.一般認為,低分子表面活性劑形成的膠束粒徑在10nm以下,但本研究中的單鼠李糖脂在低濃度范圍內能夠形成粒徑達5000nm的大型聚集體結構,而在高濃度范圍內,卻沒有發現粒徑小于10nm的聚集體.這與單鼠李糖脂分子結構有關.單鼠李糖脂的親水基/疏水基比例較小,在分子構型上可能形成了和磷脂分子POPE類似的親水基位于頂角的正三角形結構[14],這樣的構型使得單糖脂分子在溶液中形成的聚集體表面曲率更小,疏水基之間的作用更強,形成的聚集體粒徑也比較大.因此低于CMC形成的這種聚集體很可能不是實際意義上的膠束結構,而是其它的結構形式,如與磷脂分子或甘露糖赤藻糖醇酯等生物表面活性劑分子類似,形成雙層膜和膠囊結構[15-16].

3 結論

3.1 在濃度低于和高于CMC時,單鼠李糖脂在溶液中均能形成聚集體,但兩種聚集體結構上可能存在差別.

3.2 隨著濃度和pH值的增加,聚集體的粒徑均有由大變小的一般規律,且小粒徑聚集體的體積百分比增加,這分別是單鼠李糖脂聚集體分子密度的改變以及單鼠李糖脂的離解引起的分子電性變化所導致的結果.

[1] 彭子原,袁興中,彭 馨,等.生物表面活性劑逆膠束中漆酶催化性能的研究 [J]. 中國環境科學, 2013,33(6):1091-1096.

[2] Zeng G M, Chen M, Zeng Z T. Risks of neonicotinoid pesticides [J]. Science, 2013,340(6139):1403.

[3] Zeng G M, Chen M, Zeng Z T. Shale gas: surface water also at risk [J]. Nature, 2013,499(7457):154.

[4] 王 靜,曾光明,劉智峰,等.表面活性劑對熱帶假絲酵母降解十六烷的影響 [J]. 中國環境科學, 2009,29(8):822-827.

[5] Imura T, Ohta N, Inoue K, et al. Naturally engineered glycolipid biosurfactant leading to distinctive self-assembled structures [J]. Chem. Eur., 2006:2434-2440.

[6] Ishigami Y, Gama Y, Nagahora H, et al. The pH-sensitive conversion of molecular aggregates of rhamnolipid biosurfactant. Chem. Lett., 1987:763-766.

[7] Champion J T, Gilkey J C, Lamparski H, et al. Electron microscopy of rhamnolipid (biosurfactant) morphology: effects of pH, cadmium, and octadecane [J]. J. Colloid. Interface. Sci., 1995,170:569-574.

[8] Zhang Y, Miller R M. Enhanced octadecane dispersion and biodegradation by a pseudomonas rhamnolipid surfactant (biosurfactant). Appl. Environ. Microbiol., 1992,58:3276-3282.

[9] 汪小婭,曹玉華,潘 紅,等.鼠李糖脂的合成及pH值對其表面活性和微乳結構的影響 [J]. 物理化學學報, 2009,25(8):1567-1571.

[10] Zhong H, Zeng G M, Liu J X, et al. Adsorption of monorhamnolipid and dirhamnolipid on two Pseudomonas aeruginosa strains and the effect on cell surface hydrophobicity [J]. Appl. Environ. Microbiol., 2008,79:671-677.

[11] 陳宗淇,王光信,徐桂英.膠體與界面化學 [M]. 北京:高等教育出版社, 2001:180-182.

[12] Yuan X Z, Ren F Y, Zeng G M, et al. Adsorption of surfactants on a Pseudomonas aeruginosa strain and the effect on cell surface lypohydrophilic property [J]. Appl. Environ. Microbiol., 2007,76: 1189-1198.

[13] Mata-Sandovala J C, Karnsb J, Torrents A. High-performance liquid chromatography method for the characterization of rhamnolipid mixtures produced by Pseudomonas aeruginosa UG2 on corn oil [J]. J. Chromatogr. A, 1999,864:211-220.

[14] Aranda F J, Espuny M J, Marqués A, et al. Thermodynamics of the interaction of a dirhamnolipid biosurfactant secreted by Pseudomonas aeruginosa with phospholipid membranes [J]. Langmuir, 2007,23,2700-2705.

[15] Kitamoto D, Ghosh S, Ourisson G, et al. Formation of giant vesicles from diacylmannosylerythritols, and their binding to concanavalin A [J]. Chem. Commun., 2000,861-862.

[16] Kell H, Holzwarth J F, Boettcher C, et al. Physicochemical studies of the interaction of the lipoheptapeptide surfactinwith lipid bilayers of L-α-dimyristoyl phosphatidylcholine [J]. Biophys. Chem., 2007,128:114-12.

Aggregation of monorhamnolipid with concentrations near CMC in neutral solution.

TAN Fei, LIU Zhi-feng,ZHONG Hua*, ZENG Guang-ming, YUAN Xing-zhong (College of Envirnmental Science and Engineering, Key Laboratory of Environmental Biology and Pollution Control, Ministry of Education, Hunan University, Hunan 410082, China). China Environmental Science, 2014,34(11)：2912～2916

Size distribution of monorhamnolipid aggregates in neutral pH solutions with rhamnolipid concentration near critical micelle concentration (CMC) was studied. Aggregates were formed when rhamnolipid concentration was either below or above CMC. Three types of aggregates which were large (d=5000nm), medium (d=200～500nm) and small (d=40nm) in size were found. When pH was below 7.0 and the rhamnolipid concentration was below CMC, size of the medium-size aggregates decreased with increasing rhamnolipid concentration, and large-size and medium-size aggregates transformed into small-size aggregates. With the increase of solution pH, size of the medium-size aggregate also decreased, and large-size and medium-size aggregates transformed into small-size aggreqates. These observations were assumed to result from change of density and dissociation degree of monorhamnolipid molecule in the aggregates with rhamnolipid concentration and solution pH.

monorhamnolipid；agreegates；critical micelle concentration；dissociation

X131.2

A

1000-6923(2014)11-2912-05

談 菲(1991-),女,湖南長德人,湖南大學環境科學與工程學院碩士研究生,主要從事水環境污染生物修復技術研究.

2014-04-27

國家自然科學基金資助項目(50908081,51039001, 51378192,51308200,51378190)

* 責任作者, 講師, zhonghua@hun.edu.cn