中央空調系統過濾器表面真菌鑒定及溫熱控制

付柏淋,呂 陽(大連理工大學建設工程學部,建筑環境與新能源研究所,遼寧 大連 116023)

中央空調系統過濾器表面真菌鑒定及溫熱控制

付柏淋,呂 陽*(大連理工大學建設工程學部,建筑環境與新能源研究所,遼寧 大連 116023)

為研究中央空調系統真菌繁殖擴散機理及控制空氣微生物污染問題,通過溫熱控制手段,探究不同溫熱環境下真菌菌落、菌絲生長繁殖規律.以某體育館中央空調系統過濾器表面真菌為研究對象,通過分離、生理生化實驗和分子生物學鑒定確認空調系統過濾器表面的優勢菌屬種類及數量.對分離鑒定的優勢菌屬做溫熱控制實驗,分別在25℃恒溫及22℃～28℃變溫條件下觀察菌落和菌絲的生長規律.結果顯示,該空調系統過濾器表面真菌優勢菌屬為青霉屬(Penicillium spp.)和枝孢屬(Cladosporium spp.),菌落形成單位分別為600, 140cfu/c m2.溫熱控制研究表明,無論25℃恒溫或22～28℃變溫條件,青霉屬生長速度都要快于枝孢菌,且菌落直徑變化和時間成線性關系;溫熱控制對青霉屬和枝孢菌的生長繁殖具有明顯的抑制作用,溫熱控制技術在抑制空調系統真菌生長上可行.

中央空調系統；過濾器；真菌；分離鑒定；溫熱控制

隨著經濟發展及建筑舒適性要求的提高,大量居住建筑及公共建筑使用空調系統來滿足室內溫濕度的要求.而在空調系統內部,過濾器、冷卻盤管、冷凝水積水盤、加濕器等位置都為細菌、真菌等微生物提供了極佳的繁殖環境[1-5].這些繁殖的微生物,通過空調系統進入室內后,會對暴露在室內環境中的人群健康造成危害[6-8].多項醫學研究表明,真菌污染與哮喘、過敏性鼻炎及呼吸道感染有關[9].法國國家衛生與醫學研究所研究表明,室內真菌對嚴重哮喘患者的危害性是相對于其他過敏物質的2倍[10]. Somers等[11]發現吸入污染真菌顆粒的小鼠基因發生突變,這為真菌導致癌變提供了間接證明.同樣,真菌孢子極易擴散的特性也決定其危害程度,尤其當空調系統風機運行后極易將真菌及其孢子擴散到室內,造成生物污染[12].

2004年衛生部對全國近1000家賓館、商場等公共場所的中央空調系統進行抽檢,微生物合格率僅為6%,其中近50%為重度污染[13].廣州于2007年抽查5家公共場所空調系統,細菌總數檢出范圍27～930cfu/cm3,真菌總數檢出范圍7～6000cfu/cm3,依據《公共場所集中空調通風系統衛生規范》,送風中的細菌總數≤500cfu/cm3,真菌總數≤500cfu/cm3,細菌、真菌合格率均值分別為71.4%和85.7%[14].2012年大連市抽查10家酒店及賓館,依據衛生規范細菌、真菌合格率均值分別為78.3%和77.8%,雖然衛生狀況有所改善,但風管內的真菌含量仍超標數倍[15].

而在空調系統易滋生的微生物中,真菌存在比例又相對較高.陳鳳娜等[16]對國內12個省份或直轄市的空調系統調查表明,空調系統內真菌總數是細菌總數的4.49～25.19倍.李安桂等[17]對陜西歷史博物館空調系統實測研究表明,空調系統各段中真菌濃度是細菌濃度的1.60～128.06倍.盧振等[18]對哈爾濱兩棟大型公共建筑實測研究表明,空調設備表面平均濃度真菌是細菌的4.7倍.

綜上所述,研究中央空調系統真菌類微生物生長繁殖特性,并找到合適有效的控制方法極其重要.本研究通過對某體育館中央空調系統過濾器表面真菌類微生物鑒定分析,分離得出過濾器表面真菌類微生物優勢菌屬,并通過溫熱響應實驗對其生長繁殖規律進行研究,以期為使用溫熱控制手段解決空氣微生物污染問題提供資料.

1 材料與方法

1.1 實測儀器與材料

無菌無紡布(100mm×100mm)、蒸餾水、察氏培養基(蔗糖30g/L,硝酸鈉3g/L,磷酸氫二鉀1g/L,硫酸鎂0.5g/L,氯化鉀0.5g/L,硫酸亞鐵0.01g/L, 121 ℃滅菌20min后使用)、載玻片、蓋玻片、凡士林、恒溫培養箱、雙向調節溫度的培養搖床、高壓滅菌鍋、電子顯微鏡,TR-72i溫濕度自記儀等.

1.2 真菌的采樣與計數

選取某體育館中央空調系統作為實測對象,在空調系統過濾網上,用鑷子夾取無菌無紡布在5cm×5cm的區域上輕拭,采集該區域內全部積塵后將無紡布裝入滅菌袋.在無菌操作間,將擦拭物加入到無菌水中做充分清洗,使無菌無紡布上的物質完全溶于無菌水,制成菌原液.取原液,分別制備10倍、100倍梯級稀釋濃度的菌液.分別吸取3種不同濃度的溶液1mL,滴在培養基上.將培養基放置在28℃培養箱中48h后,觀察優勢菌屬菌落數.平行樣菌落數取平均值,優勢菌屬1,菌落數為600cfu/cm2,優勢菌屬2,菌落數為140cfu/cm2.

1.3 優勢菌屬的分離鑒定

1.3.1 生理生化實驗 菌落培養成型后,通過菌落表面特性及菌絲結構,結合《菌種鑒定手冊》[19]進行初步判斷.從菌落形態、顏色等生理生化特征,可見優勢菌屬1(圖1)特征為菌落空氣側白色、成絮狀;平板側菌落成翠綠色,有金色斑點.在40倍顯微鏡下觀察菌絲及孢子結構,可見菌絲有隔膜、多核,菌絲體產生掃狀分支的分生孢子梗,分生孢子為橢圓無隔孢子.優勢菌屬2(圖2)特征為菌落空氣側黑色,較平坦;菌絲有隔多核,具有足的結構.

圖1 青霉屬Fig.1 Penicillium spp.

圖2 枝孢屬Fig.2 Cladosporium spp.

圖3 青霉屬系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Penicillium spp.

圖4 枝孢屬系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Cladosporium spp.

1.3.2 分子生物學鑒定 挑取平板上從過濾網上分離出的優勢真菌,分別置于4份液體察氏培養基中,在28℃、150r/min下培養3～4d,直至培養基中出現明顯菌絲球.培養完成后,進行基因組提取.待基因組樣品提取完成,將樣品保存于-20℃,進行PCR擴增18S rDNA片段及純化,PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠上電泳,在紫外線燈下切下含目的片段凝膠,用DNA膠回收試劑盒回收目的片段,將目的片段DNA與T-載體連接,置于16℃反應12h以上.反應后進行轉化克隆和篩選陽性克隆,用質粒提取試劑盒提取質粒.通過雙酶切法(EcoR I, Hind III)驗證,將含18S rDNA的質粒測序.將測序結果使用NCBI BLAST軟件和GenBank數據庫進行同源性分析,并建立系統發育樹.經18S rDNA測序和同源性比較,真菌1與多株Penicillium spp. 18S rDNA的相似性水平達到99%,其系統發育樹如圖3所示(圖3中真菌1表示為G7).生理生化判斷及分子生物學鑒定真菌1為青霉屬(Penicillium spp.);真菌2與多株Cladosporium spp. 18S rDNA的相似性水平達到99%,其系統發育樹如圖4所示(圖4中真菌2表示為B7).生理生化判斷及分子生物學鑒定,真菌2為枝孢屬(Cladosporium spp.).

2 結果

2.1 實驗方案

為研究空調系統過濾器表面真菌類微生物在不同溫度下的生長規律,進行了恒溫培養和變溫培養.恒溫培養下(Case-1),環境溫度設定為25℃,每12h記錄1次菌落直徑;變溫培養下(Case-2),環境溫度設定變化范圍是22～28℃,每12h將22℃和28℃互換1次并記錄菌落直徑.實驗方案如圖5所示.所有實驗經過凡士林滴加蒸餾水保濕處理,相對濕度維持在恒定值90%.

圖5 實驗方案示意Fig.5 Experimental program

2.2 實驗結果

由圖6和圖7可見,無論是恒溫環境或是變溫環境,青霉屬和枝孢屬的菌落直徑均隨時間延長而繁殖擴大,但兩株真菌的增長速度和增長形態卻表現各異.在恒溫條件下(圖6),青霉屬的菌落生長速率大于枝孢屬.在變溫條件下(圖7),青霉屬相對于枝孢屬,真菌孢子極易擴散.

由圖8可知,在恒溫環境下隨著時間的推移,兩株真菌菌落直徑增殖速率成線性變化,且青霉屬的菌落生長速度要遠大于枝孢屬.可見,在恒溫條件下兩株優勢真菌呈自然增殖狀態.

圖6 25℃恒溫真菌菌落變化Fig.6 Time series of fungal colonies at constant temperature of 25℃

圖7 22～28℃變溫兩株真菌菌落變化Fig.7 Time series of fungal colonies at variable temperature ranging from 22℃ to 28℃

圖8 25℃恒溫真菌生長曲線Fig.8 Growth curve of two fungi at constant temperature of 25℃

由圖9可見, 22～28℃變溫環境下,隨著時間的推移,青霉屬于培養108h左右出現了緩慢生長至不再生長的情況,之后菌落直徑未再發生變化;枝孢屬在培養180h后也出現平緩生長的傾向.在變溫環境下,青霉屬比枝孢屬提前出現了生長停滯,溫熱響應較迅速.相對于恒溫環境,兩株真菌都較早出現了生長停滯.可見,在變溫條件下兩株優勢真菌呈受控狀態.

圖9 22～28℃變溫真菌生長曲線Fig.9 Growth curve of two fungi at variable temperature ranging from 22℃ to 28℃

3 討論

3.1 不同菌株在相同溫度環境下生長特性分析

對比圖8和圖9可知,在25℃恒溫環境培養下,青霉屬和枝孢屬兩株真菌都以一定的生長速度增殖,且一周后生長速度仍未出現放緩的趨勢,菌落直徑與時間成線性關系.可見,穩定的溫度有利于真菌生長;在22～28℃變溫環境培養下,兩株優勢菌屬的生長速度變化率降低,生長速度穩定性也不如25℃恒溫環境下,青霉屬與枝孢屬的生長都受到抑制.并且,在22～28℃變溫下青霉屬的孢子更易擴散(圖7A),推斷這與溫度變化有關.

3.2 相同菌株在不同溫度環境下生長特性分析

由圖8和圖9可知,在恒溫環境下,青霉屬快速生長;但在變溫環境下,經過96h后,青霉屬的生長明顯受到抑制,108h后青霉屬菌落不再變化.在恒溫環境下,枝孢屬的生長速度要快于變溫環境.在變溫環境下,經過180h后,枝孢屬的生長均有受到抑制的傾向.由此可見,溫熱控制對青霉屬的生長具有明顯抑制作用,對枝孢屬也有此傾向.

3.3 青霉屬和枝孢屬的菌落直徑變化分析

由表1可知,在恒溫和變溫環境下,192h后青霉屬菌落直徑分別達到36mm和24mm,而枝孢屬菌落直徑只能達到21mm和16mm.由此可知,無論在何種環境下,真菌種類特性的不同決定了青霉屬的生長速度均快于枝孢屬,溫熱控制不能改變菌種這一特性.但對于同一菌株,無論是青霉屬還是枝孢屬,在變溫環境下菌落的增殖速率均要落后于恒溫環境,由此可見,通過溫熱控制可以抑制真菌增長.

表1 不同環境下兩株真菌直徑變化(mm)Table 1 Change of two fungal diameter in different environment (mm)

4 結論

4.1 經生理生化實驗和分子生物學鑒定,本研究中央空調系統過濾器表面真菌類微生物優勢菌屬為青霉屬(Penicillium spp.)和枝孢屬(Cladosporium spp.),菌落數分別為600cfu/cm2和140cfu/cm2.

4.2 無論恒溫25℃或變溫22～28℃條件,青霉屬生長速度都要快于枝孢屬,這是溫熱控制所不能改變的.

4.3 通過恒溫和變溫實驗對比發現,無論是青霉屬還是枝孢屬,在變溫環境下菌落的生長速度變化率均要落后于恒溫環境,這一作用對青霉屬的生長更加明顯,對枝孢屬也有此傾向,可以通過溫控抑制某些菌屬的真菌繁殖.

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致謝：研究得到大連理工大學生命科學與技術學院包永明教授、袁文杰副教授大力支持,在此向所有相關研究人員表示感謝.

Identification and thermal control on fungi from the filter of central air conditioning system.

FU Bai-lin, Lü Yang*(Laboratory of Building Environment and New Energy Resource, Department of Building Engineering, Dalian University of Technology, Dalian 116023, China). China Environmental Science, 2014,34(11)：2917～2921

To explore the propagative and diffused mechanism of fungi in central air conditioning system and control air microorganism contamination problem, growth rhythms of fungal colony and mycelium were researched in different thermal environments by thermal control. Fungi separated from the filter surface of the central air conditioning system in a gym were chosen as the research objects. By isolation, physiology and biochemistry experiments, and molecular biological identification, dominant fungi on the filter of central air conditioning system were confirmed. In order to conduct thermal control experiment of separated dominant fungi, growth rhythms of fungal colony and mycelium were observed at temperature of 25℃ and 22～28℃, respectively. As a result, it was shown that the dominant fungi were Penicillium spp. and Cladosporium spp., colonies were 600 and 140 cfu/cm2respectively. It was indicated that regardless of constant or variable temperature conditions, the reproduction rate of Penicillium spp. was faster than Cladosporium spp., with a liner correlation between colony diameter and time. Penicillium spp. and Cladosporium spp were obviously restrained by temperature change control. Thermal control was feasible for restraining fungal growth in air conditioning system.

central air conditioning system；filter；fungi；isolation and identification；thermal control

X172

A

1000-6923(2014)11-2917-05

付柏淋(1988-),男,遼寧大連人,大連理工大學碩士研究生,主要從事室內空氣品質研究.

2014-02-17

國家自然科學基金資助項目(51308088);高等學校博士點專項基金(20120041120003);北京市重點實驗室研究基金(NR2013K05);大連理工大學基本科研業務費專項(DUT14QY24).

* 責任作者, 副教授, lvyang@dlut.edu.cn