轉Bt水稻土壤微生物多樣性對O3濃度升高的響應

李春艷,劉 標,韓正敏,曾 青,李春華,朱建國(.環境保護部南京環境科學研究所,生物安全重點實驗室,江蘇 南京 2002；2.南京林業大學森林資源與環境學院,江蘇 南京 20037；3.遼寧農業職業技術學院,遼寧 營口 5009；.中國科學院南京土壤研究所,土壤與可持續農業國家重點實驗室,江蘇 南京 20008)

轉Bt水稻土壤微生物多樣性對O3濃度升高的響應

李春艷1,2,3,劉 標2*,韓正敏1,曾 青4,李春華4,朱建國4(1.環境保護部南京環境科學研究所,生物安全重點實驗室,江蘇 南京 210042；2.南京林業大學森林資源與環境學院,江蘇 南京 210037；3.遼寧農業職業技術學院,遼寧 營口 115009；4.中國科學院南京土壤研究所,土壤與可持續農業國家重點實驗室,江蘇 南京 210008)

利用中國農田開放式O3濃度升高(O3-FACE)平臺,于2010年和2011年對O3濃度升高和田間自然條件下轉Bt基因水稻Bt汕優63(Bt-SY63)及其常規水稻汕優63(SY63)根際土壤微生物群落功能多樣性進行了研究.結果表明, O3濃度升高使Bt-SY63和SY63水稻土壤微生物總體活性有降低的趨勢, O3濃度升高未使兩基因型水稻土壤微生物的豐富度、優勢度和均一度發生顯著變化. O3濃度升高顯著地改變了Bt-SY63土壤微生物碳源基質的利用方式,使其土壤微生物由對糖類及其衍生物具有較強的利用能力轉向對代謝中產物和次生代謝物具有較強的利用能力,而對SY63土壤微生物碳源基質的利用沒有顯著影響.因此,從稻田土壤微生物群落對O3濃度升高的不同響應來看,Bt-SY63可能比SY63更敏感.

O3；O3-FACE；轉Bt水稻；土壤微生物；功能多樣性

近地層O3濃度的持續升高對植物的形態結構、生理生化、生長繁殖等都造成不同程度的損傷[1-3],關于O3濃度升高對農作物生物量和產量的影響,國內外學者更是進行了大量的研究[4-6].然而,目前關于O3濃度升高對土壤微生物影響的研究相對較少且集中于對微生物群落結構影響方面[7-8],對微生物群落功能方面影響的研究較少.近地層O3濃度升高對土壤生態系統的影響研究非常重要[9],不僅是因為土壤微生物群落作為土壤分解系統的主導者,在推動土壤物質轉換、能量流動和生物地球化學循環中扮演著重要作用[10],其多樣性變化還可以敏感地指示氣候和土壤環境條件的變化,土壤微生物群落結構與功能的改變直接關系到土壤營養物質的分解與循環,進而影響植物的養分吸收[8,11].

此外,轉Bt基因作物還存在著非預期性狀變化[12-14],這種非預期變化可能導致地下生態系統的改變.轉基因抗蟲作物的外源基因及其表達產物還可通過根系分泌或作物殘體等途徑進入土壤[16-17],從而可能影響土壤微生物群落活性.迄今為止,關于O3濃度升高對轉Bt基因水稻土壤根際微生物群落功能多樣性的影響,國內外均未見報道.

本試驗采用國際先進的、更接近自然的O3-FACE(free-air O3concentration enrichment,開放式空氣O3濃度升高)技術,研究農田生態系統土壤微生物群落對O3濃度升高的響應及其在高O3濃度下的功能效應,以期充實轉基因植物生態安全方面的理論基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗地及O3-FACE系統

試驗地位于江蘇省江都市小紀鎮良種場(119°42′0″E,32°35′5″N)的中國O3-FACE系統研究平臺,該地耕作方式為水稻-冬小麥復種,是典型的稻麥復種農田生態系統.該地年均降水量980mm左右,潛在年蒸發量>1100mm,年平均溫度14.9℃,年日照時間>2100h,年無霜期220d.試驗用土取自育秧田表層(0～20cm)土壤.土壤類型為砂漿水稻土,理化性質:容重為1.2g/cm3,有機質含量、全氮、全磷、全鉀分別為17.42,1.59,1.23, 14.02mg/kg, pH 6.8.

O3-FACE平臺于2007年3月開始運行,試驗平臺設有3個O3處理圈(升高的O3濃度)和3個對照圈(環境O3濃度).O3處理圈設計為直徑14m的正八面形,O3處理圈與對照圈之間間隔大于70m,以減少O3釋放對對照圈的影響.通過圍成正八角形的8根橡膠管帶上直徑0.5mm×0.9mm的小孔在作物冠層上方50～60cm向圈中心噴射O3氣體,晴天每天09:00～18:00釋放O3,電腦控制使O3處理圈內O3濃度始終保持在對照圈的1.5倍,控制誤差為10%.對照田塊沒有安裝管道,環境條件與自然狀態完全一致.2010年O3處理圈布氣時間為7月2日～10.8,2011年布氣時間為6月27日～10月20日.試驗期間O3處理圈和對照圈的O3濃度變化見圖1.

圖1 2010年和2011年O3處理圈與對照圈O3濃度變化情況Fig.1 The O3concentrations in O3-FACE and ambient air in 2010 and 2011

1.2 試驗材料及育苗

2010年及2011年開始盆栽種植轉基因和非轉基因水稻.供試水稻品種Bt汕優63(Bt-SY63)及其親本常規稻汕優63(SY63)由華中農業大學提供.Bt-SY63中表達的是cry1Ab/Ac基因,用于控制二化螟等鱗翅目害蟲.2010年水稻季于. 2010年6月8日開始浸種、催芽,6月13日育秧,6月23日移栽,分設在3個O3處理圈和3個對照圈,每品種每圈(每個處理)放置25盆,盆長23cm、寬18cm、高25cm,1m2內放置24盆,每盆裝土6.3kg.盆半埋入土,每盆種植1穴,1穴2株,全生育期保持2～3cm水層,收獲前一周左右停水.2011年水稻季于5月18日開始浸種、催芽,5月21日育秧,6月22日移栽,10月4日收獲,其他試驗設計同2010年.

肥料管理:整個生育期需N 15g/m2,P2O5和K2O各7g/m2,分別由尿素(46%N)、P2O5和K2O提供.移栽前施用基肥:40%的N,100%的P和K;分蘗早期和抽穗期分別施30%的N,其他田間管理如蟲草害等同大田一致[18].

1.3 土壤樣品采集

2010年7月25日(分蘗期),8月21日(抽穗期),9月19日(灌漿后期)和2011年7月27日(分蘗期),8月23日(抽穗期),9月23日(灌漿后期)采集土壤樣品.每次每個處理(每品種每圈)按“S”形法抽取5盆水稻,用直徑5cm的土鉆破壞性采集0～15cm土層的根系周圍土壤樣品,裝入無菌塑料袋里,盡快帶回實驗室,用于測定水溶性有機碳含量的土壤經自然風干后過20目篩(0.90mm孔徑)備用,用于BIOLOG分析的土壤置于4℃保存,并在取樣后 24h內完成.

1.4 土壤樣品處理與分析

水溶性有機碳測定:稱取相當于20g干土的上述過篩土樣,加入滅菌蒸餾水40mL,置于22℃, 180r/min的搖床上振蕩30min后取出,于7000r/min的高速離心機中離心15min,然后過0.45μm濾膜.濾液于耶拿公司TOC-總有機碳分析儀(Mutli N/C 3100)上測定.

BIOLOG分析:稱取相當于5g烘干土重的新鮮土樣,加入裝有45mL滅菌的0.85%(W/V) NaC1溶液中,置于22℃,180r/min的搖床上振蕩30min后取出,靜止3min后吸取土壤懸液1mL加入裝有9mL滅菌的0.85%NaCl溶液的試管中,震蕩搖勻稀釋成10-2的稀釋液,以此類推得到10-3稀釋液.用8通道加樣器吸取10-3稀釋液接種到Biolog ECO板中,每孔150μL,置于培養箱中25℃培養,每隔24h(直到168h)在Biolog Reader上讀取各孔在590nm波長下的光吸收值(OD).Biolog ECO微平板和Biolog Reader購自美國BIOLOG公司(BIOLOG,Hayward,USA).

1.5 數據處理與統計分析

計算Shannon-Wiener(H)指數用于評估土壤微生物群落中物種的豐富度即群落所含物種的多寡.計算Simpson(D)指數用于評估土壤微生物群落中最常見物種的優勢度.計算Mcintosh(U)指數用于評估土壤微生物群落中物種的均一度.基礎數據采用SPSS軟件(SPSS Inc., version 16.0)進行方差分析.培養72h的平均吸光值采用分期的one-way ANOVA方法進行數據分析,土壤水溶性有機碳、Shannon-Wiener(H)、Simpson(D)和Mcintosh(U)指數采用廣義線性模型的重復測量程序(O3濃度作為因素,生長時期作為重復測量因子)進行方差分析.土壤微生物群落代謝特征采用CANOCO4.5進行主成分分析(PCA).

2 結果與討論

2.1 土壤水溶性有機碳含量對O3濃度升高的響應

圖2 2010和2011年不同采樣時期環境O3濃度和升高O3濃度 水稻土壤水溶性有機碳含量變化Fig.2 Variation of water soluble organic C of rice soil under ambient and elevated O3conditions at different sampling times in 2010 and 2011

圖2中的廣義線性模型的重復測量方差表明,與環境O3濃度相比,O3濃度升高有降低土壤水溶性有機碳含量的趨勢,但O3處理及O3處理與時間(生長時期)的交互作用對Bt-SY63和SY63兩基因型水稻的土壤水溶性有機碳含量均沒有顯著影響(P>0.05).土壤水溶性有機碳含量存在著顯著的時間效應,即隨著生長期的延長,兩基因性水稻土壤水溶性有機碳含量逐漸降低.

2.2 土壤微生物碳源代謝活性對O3濃度升高的響應

圖3 2010年不同采樣時期升高O3濃度和環境O3濃度條件下水稻土壤中平均吸光值的變化Fig.3 Variation of AWCD values with the incubation time of rice soil under ambient and elevated O3condition at different sampling times in 2010

平均吸光值(AWCD)是Biolog板上所有碳源基質被微生物利用后的整體反應的指標,反映了微生物群落的總體活性.圖3和圖4所示,對于Bt-SY63,2010年和2011年各生育期采樣中O3濃度升高下,土壤微生物群落AWCD低于環境O3濃度下.2010年抽穗期除外,其他各生育期采樣中O3濃度升高和環境O3濃度條件下土壤的AWCD差異均未達到顯著性水平(表1).

而對于SY63,2010年分蘗期和抽穗期及2011年灌漿后期O3濃度升高下,土壤微生物群落AWCD低于環境O3濃度條件下,2011年分蘗期和抽穗期O3濃度升高下,土壤微生物群落AWCD高于環境O3濃度下,2010灌漿后期O3濃度升高下和環境O3濃度下土壤微生物群落AWCD隨時間變化趨勢幾乎相同(圖3和圖4).但是兩年各生育期采樣中土壤的AWCD差異均未達到顯著性水平(表1).

圖4 2011年不同采樣時期升高O3濃度和環境O3濃度條件下水稻土壤中平均吸光值的變化Fig.4 Variation of AWCD values with the incubation time of rice soil under ambient and elevated O3conditions at different sampling times in 2011

表1 2010和2011年各生育期升高O3濃度和環境O3濃度條件下水稻土壤中平均吸光值(培養72h測定值)Table 1 The average well color development (AWCD) of rice soil under ambient and elevated O3conditions at different growth stages during 2010-2011 (measured at 72h)

近地層O3對土壤生態系統的組分難以產生直接的影響,因為O3不能穿透入土壤[19].因此,O3可能通過影響植物生理過程和C分配而間接地改變土壤生態系統[20-21].本研究兩年的數據表明,無論是對于轉基因水稻Bt-SY63還是常規水稻SY63,近地層O3濃度升高下稻田土壤水溶性有機碳含量下降,從而影響了土壤微生物對部分碳源的利用能力,進而導致高O3濃度下土壤微生物群落AWCD最終低于環境O3濃度下土壤微生物群落AWCD值,這可能與O3濃度升高降低了兩基因型水稻向根系的碳輸入及根中的碳分配、減少根系分泌物,從而影響土壤微生物的活性有關[22-23].

2.3 土壤微生物群落代謝功能多樣性對O3濃度升高的響應

選取72h的平均吸光值計算出Shannon-Wiener、Simpson以及McIntosh 3種土壤微生物群落代謝功能多樣性指數,結果見表2.表中的方差表明,高濃度O3暴露沒有導致Bt-SY63和SY63水稻土壤微生物群落的豐富度、優勢度及種群分布均勻度的顯著變化,但兩基因型水稻的上述三種土壤微生物群落代謝功能多樣性指數存在著年度和季節變化,這與Cotta等[24]的部分研究結果一致.

表2 2010年和2011年各生育期水稻根系土壤微生物代謝功能多樣性指數Table 2 Functional diversity indices of rice soil microbial community at different growth stages during 2010-2011

2.4 土壤微生物群落碳源利用對O3濃度升高的響應

2.4.1 Bt-SY63水稻根系土壤微生物群落碳源利用對O3濃度升高的響應 通過對2010年和2011年各生育期轉基因水稻Bt-SY63水稻根系土壤微生物群落碳源代謝72h時測定的AWCD值進行主成分分析(PCA)(圖5),以此評價Bt-SY63兩年不同處理中土壤微生物群落在碳源利用上的整體差異.

從圖5看出,綜合2010年和2011年兩年6次采樣情況,O3濃度升高和環境O3濃度下Bt-SY63稻田土壤樣品在PC2軸上出現了明顯的分異,環境O3濃度下土壤樣品主要分布在PC2軸正方向,而O3濃度升高下土壤樣品主要分布在PC2軸負方向,說明O3濃度升高對Bt-SY63稻田土壤微生物群落碳源基質利用的影響達到了顯著性水平.此外,O3濃度升高下與環境O3濃度下的土壤樣品分異距離隨O3處理的時間逐漸增加.

圖5 2010～2011年不同處理的轉基因水稻Bt-SY63土壤微生物群落碳源代謝的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of carbon metabolism of soil microbial community in Bt-SY63 under ambient and elevated O3conditions at different growth stages during 2010-2011

表3 2010年和2011年轉基因水稻Bt-SY63土壤中與PC1和PC2顯著相關的微生物主要利用碳源Table 3 Main carbon resources of soil microbial utilization related to PCA l and PCA 2 in Bt-SY63 during 2010-2011

通過比較O3濃度升高和環境O3濃度下Bt-SY63水稻土壤微生物群落對Biolog ECO平板中4類碳源的優先利用順序,可以看出不同處理下Bt-SY63水稻土壤微生物群落碳源特異利用的情況.綜合2010年和2011年兩年6次采樣,主成分1和主成分2中具有較高相關系數(︱r︱>0.6)的碳源見表3.

結合圖5和表3可以看出, 環境O3濃度下Bt-SY63水稻土壤微生物群落對與主成分2正相關程度較高的碳源如糖類及其衍生物中的D-葡萄胺酸、α-D-乳糖、D-半乳糖酸γ-內酯,氨基酸及其衍生物中的L-絲氨酸,脂肪酸和脂類中的y-羥基丁酸等5種碳源具有相對高的利用能力,而O3濃度升高下Bt-SY63水稻土壤微生物群落對主成分2負相關程度較高的碳源如代謝中產物和次生代謝物中的D-蘋果酸以及脂肪酸和脂類中的吐溫40等2種碳源具有相對高的利用能力.

2.4.2 SY63水稻根系土壤微生物群落碳源利用對O3濃度升高的響應 對于常規水稻SY63,采用與轉基因水稻Bt-SY63同樣的方法對2010年和2011年各生育期水稻根系土壤微生物群落碳源代謝進行主成分分析(圖6).

圖6 2010～2011年不同處理的常規水稻SY63土壤微生物群落碳源代謝的主成分分析Fig.6 Principal component analysis of carbon metabolism of soil microbial community in SY63 under ambient and elevated O3conditions at different growth stages during 2010-2011

從圖6中可看出,綜合2010年和2011年兩年6次采樣情況,O3濃度升高和環境O3濃度下SY63稻田土壤樣品無論是在PC1還是在軸PC2軸上都沒有出現明顯的分異,說明O3濃度升高對SY63稻田土壤微生物群落碳源基質的利用沒有顯著影響,碳源利用的種類沒有偏好的選擇.此外,O3濃度升高下與環境O3濃度下的土壤樣品分異距離隨O3處理的時間逐漸增加.

主成分分析可以在降維后的主元向量空間中,用點的位置直觀地反映出不同O3處理中土壤微生物群落多樣性變化.本研究的主成分分析表明O3濃度升高顯著地影響了Bt-SY63稻田土壤微生物群落碳源基質的利用,碳源基質由糖類及其衍生物向代謝中產物和次生代謝物轉變,這可能是由于受脅迫的植物根系分泌物的種類和數量均有改變的緣故,需要進一步研究[9].然而,O3濃度升高對SY63稻田土壤微生物群落碳源基質的利用沒有顯著影響,對碳源利用的種類也沒有定向的選擇.因此,從稻田土壤微生物群落對O3濃度升高的不同響應來看,Bt-SY63可能比SY63對高濃度O3更敏感,這一現象與可以從我們以前發現的“相對于O3脅迫對葉片超微結構造成的損傷而言,Bt-SY63比SY63對高濃度O3更敏感”[25]是一致的,即與SY63相比,Bt-SY63的生長發育更易受到O3脅迫的影響,導致Bt-SY63的根系分泌物的種類和數量更容易發生改變,從而間接影響了土壤微生物群落活性的變化.此外,主成分結果分析結合碳源利用譜結果分析發現,不論Bt-SY63還是SY63,同一年度不同生育期間和同一生育期不同年度間土壤微生物群落碳源利用種類的穩定性較差,土壤微生物群落的碳源利用種類存在著年度和季節變化,這可能也是Bt-SY63和SY63土壤微生物群落的豐富度、優勢度及種群分布均勻度等三種多樣性指數存在著年度和季節變化的原因之一.

土壤微生物群落對環境脅迫的響應通常先經環境擾動期,隨時間推移可通過群落結構的改變或群落大小的改變亦或其他方面變化對環境脅迫產生適應性,來達到功能的逐漸恢復.Liu等[26]和Ruyters等[27]就曾發現氨氧化細菌是通過改變群落結構逐漸對重金屬汞和鋅污染產生了適應性,從而逐漸恢復了其硝化活性.本試驗中觀察到的O3濃度升高下與環境O3濃度下的兩基因型水稻土壤樣品主成分分析中分異距離隨O3處理時間延長逐漸增加的現象,一方面說明了土壤微生物在群落碳源代謝功能上對O3濃度升高的響應與取樣時土壤微生物相對于O3暴露所處的生理狀態密切相關,即分蘗期取樣,土壤微生物處于環境擾動狀態,O3濃度升高下與環境O3濃度下其代謝方式尚無明顯區分,分異距離小;隨O3處理的時間延長,至灌漿后期,土壤微生物對O3暴露產生了適應性,與Ambient下相比,其代謝方式明顯不同,分異距離也隨之增加;另一方面也暗示土壤微生物群落對O3濃度升高的適應可能是通過改變了的群落結構來實現的.

BIOLOG技術雖常被用于研究土壤微生物群落功能,但是BIOLOG微平板只能表征土壤中生長快速或富營養微生物的活性,而不能反映土壤中生長緩慢或不可培養微生物活性,也不能對土壤真菌進行研究[28].因此, O3濃度升高對土壤微生物群落功能多樣性影響的研究尚需進一步展開和長期跟蹤研究.

3 結論

本文利用農田開放式O3濃度升高平臺對2010年和2011年O3濃度升高和田間自然條件下轉Bt基因水稻Bt-SY63及其常規水稻SY63根際土壤微生物群落功能多樣性進行了研究,發現O3濃度升高使Bt-SY63和SY63水稻土壤微生物總體活性有降低的趨勢,而未使兩基因型水稻土壤微生物的豐富度、優勢度和均一度發生顯著變化.O3濃度升高使Bt-SY63土壤微生物碳源基質的利用方式由對糖類及其衍生物具有較強的利用能力轉向對代謝中產物和次生代謝物具有較強的利用能力,而對SY63土壤微生物碳源基質的利用沒有顯著影響.因此,從稻田土壤微生物群落對O3濃度升高的不同響應來看,Bt-SY63可能比SY63更敏感.

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Responses to elevated O3of soil microbial diversity from transgenic Bt rice.

LI Chun-yan1,2,3, LIU Biao2*, HAN Zheng-min1, ZENG Qing4, LI Chun-hua4, ZHU Jian-guo4(1.Key Biosafety Laboratory in Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Nanjing 210042, China；2.College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China；3.Liaoning Agricultural College, Yingkou 115009, China；4.State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Sciences, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China). China Environmental Science, 2014,34(11)：2922～2930

Using a free-air concentration enrichment (FACE) system, field studies were conducted on functional diversity of soil microbial community from two rice lines, transgenic Bt Shanyou 63 (Bt-SY63) and its non-transgenic counterpart (SY63), in elevated O3(E-O3) versus ambient O3(A-O3) condition during 2010～2011. The results indicated that the AWCD (average well colour development) values of Bt-SY63 and SY63 tended to decrease as O3increased. No significant ozone effects (P > 0.05) were detected on Simpson, Shannon and McIntosh indices of functional diversity of the soil microbial communities in Bt-SY63 and SY63. Edaphon’s ability to utilize the substrates of some specific carbon resources was significantly affected (P < 0.05) by E-O3in Bt-SY63 from the original carbohydrates and their derivants to the metabolic mediates and secondary metabolites, whereas SY63 was not significantly affected (P < 0.05) by E-O3. The results suggested that Bt-SY63 might be more sensitive to E-O3than SY63 with respect to the different responses to E-O3in the soil microbial community.

elevated O3；O3-FACE；transgenic Bt rice；soil microbial；functional diversity

X172

A

1000-6923(2014)11-2922-09

李春艷(1973-),女,內蒙古通遼人,副教授,博士,主要從事生物安全及環境微生物研究.發表論文20余篇.

2014-02-26

轉基因新品種培育重大科技專項(2014ZX08012-005);國家自然科學基金(31370544);南京林業大學優秀博士學位論文創新基金項目(2011YB009);江蘇省普通高校研究生科研創新計劃資助項目(CXZZ11_0504);中國科學院知識創新方向項目(KZCX2-EW-414).

* 責任作者, 研究員, 85287064@163.com