一株云杉八齒小蠹伴生藍變真菌的鑒定及致病性測定

曹翠　宋瑞清　周秀華

摘要 [目的]確定1株云杉八齒小蠹伴生藍變真菌C59的分類地位。[方法]對分離自伊春市五營區黑龍江豐林國家級自然保護區紅皮云杉林內的一株云杉八齒小蠹伴生藍變菌株進行培養特性、形態學特征觀察和18S rDNA ITS序列分析鑒定，在對該藍變菌株進行接種的同時，測定了該菌株的致病性，苗木感病后韌皮部的水分代謝，針葉葉綠素含量，韌皮部可溶性糖、蛋白質、MDA和脯氨酸含量。[結果]該藍變菌株為Ophiostoma sp.，該菌株使接種苗木韌皮部發生藍變，影響苗木韌皮部的水分代謝，導致苗木針葉葉綠素含量、韌皮部可溶性糖含量、韌皮部蛋白質含量下降，使苗木韌皮部MDA含量和脯氨酸含量上升。[結論]分離自伊春市五營區黑龍江豐林國家級自然保護區紅皮云杉上的云杉八齒小蠹伴生藍變菌株為Ophiostoma sp.，該菌株對紅皮云杉苗木具有很強的致病性。

關鍵詞 紅皮云杉；藍變菌株；鑒定；致病性

中圖分類號 S763 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）03-00749-06

Abstract [Objective] The taxonomic status of blue-stain fungal strain associated with Ips typographus isolated from Picea koraiensis was determined. [Method] The blue-stain fungal strain associated with Ips typographus isolated from Picea koraiensis in Heilongjiang Fenglin National Nature Reserve of Wuying district of Yichun city， was identified as Ophiostoma sp. based on culture characteristics， morphological features and 18S ITS sequence analysis. [Result] The result of pathogenicity test showed that the blue-stain fungal strain can make the phloem color of the inoculated seedlings turn to blue； affect water metabolism of seedling phloem； cause chlorophyll content， soluble sugar content and protein content decreased； and led MDA levels and proline content increased. In conclusion， Ophiostoma sp. [Conclusion] The blue-stain fungal strain associated with Ips typographus， isolated from Picea koraiensis in Heilongjiang Fenglin National Nature Reserve of Wuying district of Yichun city has a strong pathogenicity to Picea koraiensis.

Key words Picea koraiensis； Blue-stain fungal strain； Identification； Pathogenicity

紅皮云杉（Picea koraiensis）是我國東北地區的鄉土樹種，是長白山至小興安嶺森林的主要組成樹種之一。紅皮云杉木材輕軟、細致，可供建筑、家具、造紙等用材。其樹姿優美，抗感染力強，又是城市觀賞、綠化較佳的樹種。因此，紅皮云杉是我國經濟價值和生態價值均很高的樹種之一。

木材藍變是針葉材價值損失的主要原因之一[1]。木材藍變主要由具有暗色菌絲的真菌引起，少數真菌分泌著色物質使細胞壁變色。Bridges和Christiansen等研究認為被害寄主樹木的死亡是小蠹蟲和共生真菌聯合作用的結果，而寄主樹木木質部組織的藍變和迅速壞死則主要由真菌所致[2-3]。變色菌引起的變色只滲入木材表面，幾乎僅局限于邊材，沒有或很少與心材有關，故又稱邊材變色[4]。大量研究已證明了藍變對木材產品性質的影響。木材變色菌雖然不會導致木材腐朽，但是會使木材變黑、變青或變藍，導致材面污染。木材藍變后，除了邊材的滲透性增加，還會使木材沖擊彎曲強度受損。木材藍變嚴重降低木材的使用價值和經濟價值，給林業和生態環境建設造成巨大的損失。

筆者在前期研究的基礎上，對在黑龍江豐林國家級自然保護區的紅皮云杉林內分離的1株云杉八齒小蠹伴生藍變真菌C59 [5]進行形態學和18S rDNA ITS序列分析，以確定其分類地位，同時對菌株C59的致病性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

藍變菌株C59：試驗菌株分離自黑龍江豐林國家級自然保護區內云杉八齒小蠹坑道內。

接種植物：選自哈爾濱市市郊柳樹林苗圃的紅皮云杉8年生健康苗木。

1.2 藍變菌株的鑒定

1.2.1 培養特性及形態學研究。

（1）培養特性研究。將藍變菌株接種于改良PDA平板培養基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，水1 000 ml）上，24～25 ℃、黑暗條件下培養。觀察菌落的生長狀態。

（2）形態特征研究。用改良PDA平板培養基培養藍變菌株直至產孢。顯微鏡下觀察分生孢子梗、菌絲、分生孢子、子囊殼、子囊孢子等形態特征以及分生孢子的著生方式，照相記錄。

1.2.2 18S rDNA ITS序列。

DNA提取采用CTAB法[6]，采用真菌的通用引物進行rDNA ITS序列擴增，引物ITS1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3（20）和ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3（20），由大連寶生物有限公司合成。

PCR擴增在Gene Amp PCR System 9700 PCR儀上進行，20 μl的反應體系擴增條件為：20 μl的反應體系中去離子水11.7 μl，10 ×PCR buffer（含Mg2+ ）2.0 μl，dNTP（ 2.5 mmol/L）2.0 μl，ITS1（20 μmol/L）1.0 μl，ITS4（20 μmol/L）1.0 μl，Taq酶（5 μ/μl）0.3 μl，DNA模板（20 μl）2.0 μl。

PCR反應參數為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，30個循環，最后在72 ℃延伸10 min，每次反應均設置1個空白對照，以去離子水代替模板，以排除系統誤差。PCR擴增產物用1.0%的瓊脂糖（含0.5 μg/ml EB）電泳，在UVP凝膠成像系統下成像保存[7]。

PCR產物測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。將測得的ITS序列在GenBank 進BLAST，從GenBank核酸序列數據庫進行比對，獲得相似率較高、親源關系較近的物種，研究其中的系統發育關系。通過DNA MAN及DNAClub軟件對所需要的序列進行調整，以UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetric Mean）方法構建系統發育樹。

1.3 致病性測定

1.3.1 接種體的制備。

用直徑10 mm無菌打孔器，在無菌條件下切取改良PDA平板培養基上培養7 d的藍變菌株菌落，接種于盛有250 ml改良PD液體培養基的三角瓶（500 ml）中，每瓶接種6片。置25 ℃轉速150 r/min搖床中培養15 d后，用墊有雙層無菌濾紙的布氏漏斗真空抽濾，濾去菌絲即得接種體原液。

1.3.2 接種。采用針刺后涂抹接種體的方式接種。

在距地面5～20 cm苗木莖部，由上至下按相等間距分別設1、2、4個接種點，每個接種點接種接種體0.1 ml。接種后用塑料薄膜保濕。分別以針刺后不接種（CK1）、針刺后接種無菌液體培養基（CK2）和無處理（CK3）作為對照。每處理設置7個重復。

1.3.3 接種后觀測及生理生化指標測定。

分別在接種后的第1、7、14、21、28天測定針葉葉綠素含量并觀測接種點上下韌皮部反應區的縱向長度。葉綠素含量測定采用乙醇-丙酮混合浸泡法[8]，韌皮部反應區長度的測量采用直尺測量，重復3次取其平均值[9]。

28 d測定各處理苗木韌皮部其他生理生化指標。水分含量測定采用常壓加熱干燥法[9]，可溶性糖測定采用蒽酮比色法[8]，可溶性蛋白測定采用考馬斯亮藍G-250染色法測定[8]，丙二醛采用硫代巴比妥酸法[8]，游離脯氨酸測定采用茚三酮比色法[8]。

1.3.4 數據分析。

采用SPSS軟件進行統計分析。數據采用單因素簡單方差分析（one-way ANOVA）處理，如處理間有顯著差異性存在，進一步應用最小顯著差數法（Least Significant Difference，LSD）做多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 藍變菌株鑒定結果

2.1.1 培養特性及形態學特征。

2.1.1.1 培養特性。菌株在改良PDA平板培養基（直徑為90 mm）上生長7 d可長滿平板。菌落呈毛氈狀較稠密，氣生菌絲較少；初為灰白色，后變為灰棕色。在菌落中心形成黑色圈，無氣味。在改良PDA培養基上未見子囊果形成。

2.1.1.2 形態學特征。菌絲直或彎曲且有隔，有的有分支。分生孢子梗細長，褐色，長300～600 μm，有分支。分生孢子單細胞，大小5～8 μm×18～24 μm，淺色，長形，偶爾稍彎曲或一段稍尖，原生質分裂成數團（圖1）。

2.2 致病性測定結果

2.2.1 苗木韌皮部變色反應。

小蠹蟲伴生菌通過小蠹蟲的蛀害被攜帶進入寄主樹木組織內，并在樹體中生長繁殖，消耗樹木養分，破壞韌皮細胞，使韌皮組織壞死，在韌皮部形成1個長橢圓形的棕褐色壞死區域即韌皮反應區，反應區的長度常用衡量菌所產生的致病力強弱，反應區越長，伴生菌的致病力越強，反應區越短，表示伴生菌的致病力越弱[10]。

接種后第1、7、14、21、28天，菌株C59接種苗木其接種點周圍的韌皮組織逐漸形成1個縱向、長橢圓形、棕褐色壞死區域，即韌皮部抗性與生理反應區。韌皮反應區長度隨時間的延長而逐漸增大，接種后1～21 d，反應區長度增長較快（約0.27 cm/d），之后逐漸減慢，增長約0.23 cm/d。CK1（針刺無接種）和CK2（針刺后接種PD液體培養基）苗木其接種點的反應區長度變化很小，尤其CK1苗木機械損傷區更小（圖3）。

對照CK1接種點的反應區為接種時機械傷害所致，因此機械傷害作用較小；而接種菌株C59苗木所形成的較大反應區是菌株C59的侵染所導致。另外，CK2苗木反應區稍大于CK1苗木。這表明無菌培養液對韌皮部變色有一定影響。有關無菌培養液對韌皮部變色的影響有待進一步研究。

2.2.3.3 接種時間對不同接種苗木葉綠素含量的影響。

隨著接種后時間的增長，各處理苗木葉綠素含量隨時間變化趨勢不同（圖11）。

CK1-1和CK1-2葉綠素含量呈現下降-上升-急速下降趨勢。處理后第1天，與CK3相比，CK1-1、CK1-2和CK1-4葉綠素含量分別下降0.84%、4.64%、2.36%；接種后第21天，CK1-1葉綠素含量上升1.6個百分點，CK1-2和CK1-4分別下降8和21個百分點，之后急速下降；處理后第28天CK1-1、CK1-2和CK1-4葉綠素含量分別下降21.9、36.8、43.0個百分點。

CK2葉綠素含量呈現逐漸下降趨勢。處理后第1天，CK2-1、CK2-2和CK2-4的葉綠素含量分別下降5.1、8.5、15.5個百分點，第28天分別下降42.6、50、59.4個百分點。

接種C59苗木其葉綠素含量則呈逐漸急速下降-平穩下降的趨勢。接種后第1天，C59-1、C59-2和C59-4葉綠素含量分別下降3.8、17.4、12.8個百分點，之后急速下降；第7天分別下降31.0、37.4、45.0個百分點，之后下降較平穩；第28天下降率分別為57.5、62.7、65.8個百分點。

上述結果一方面可能是由于真菌侵染引起苗木樹勢衰弱和代謝紊亂，導致苗木的光合能力逐步下降，使葉綠素的生物合成速度減緩；另一方面可能是菌株侵染危害引起植物體內活性氧（如O2-·、H2O2、·OH和O2等）的積累和水分的缺乏[12]，導致葉綠素分解加快，分解速率大于合成速率，進而使葉片逐漸失綠。

2.2.4 苗木韌皮部可溶性糖的變化。

2.2.4.1 不同處理對苗木韌皮部可溶性糖含量的影響。

可溶性糖是植物體內重要的能源儲備物，與植物組織的代謝合成有密切關系。不同處理對苗木韌皮部可溶性糖含量的影響顯著（圖12）。CK3可溶性糖含量最高，CK1和CK2次之，接種C59苗木可溶性糖含量最低。產生上述結果的原因可能是：①菌株C59在苗木韌皮部、木質部間蔓延，使苗木的物質合成和代謝受阻，特別是光合作用產物的運輸嚴重受阻，從而使苗木韌皮部碳水化合物等儲備物減少；②菌株C59的侵染引起苗木長勢衰弱、針葉失水、枯萎脫落等勢必導致苗木光合能力逐步下降，進而引起碳水化合物合成和代謝發生變化，使苗木韌皮部營養物質含量降低；③可溶性糖含量下降也與菌株C59侵染苗木后分解木質部薄壁細胞和利用木質部管胞胞間和薄壁細胞內多糖等物質有密切關系。

2.2.4.2 接種點數量對苗木韌皮部可溶性糖含量影響。

接種點數量與苗木可溶性糖含量呈明顯的負相關（圖12）。接種后28 d，與CK3相比，CK1-1、CK1-2和CK1-4可溶性糖含量分別下降了2.38、3.49和12.79個百分點，CK2-1、CK2-2和CK2-4分別下降了5.81、10.47、23.26個百分點。接種C59苗木C59-1、C59-2和C59-4則分別下降了38.40、63.00、71.00個百分點。

隨著針刺點數的增加，苗木受機械損傷的面積增大，導致可溶性糖含量下降，這一結果與黃瓜植株機械損傷后期可溶性糖含量下降的結果一致[13]，可溶性糖含量下降說明可溶性糖對降低滲透勢、維持細胞膨壓的貢獻大，從而抵抗針刺的損傷。而對于接種C59苗木，除了機械損傷面積增大外，也增加接種C59的量，因此對苗木傷害的嚴重程度增大。對CK2來講，無菌培養液中本身就含有可溶性糖，因此隨著接種無菌培養液量的增加，導致CK2-4可溶性糖含量高于CK1-4。

2.2.5 苗木韌皮部蛋白質含量的變化。

2.2.5.1 不同處理對苗木韌皮部蛋白質含量的影響。

不同處理對苗木韌皮部蛋白質含量的影響顯著（圖13）。CK3蛋白質含量最高，CK1、CK2均下降程度小，而接種C59苗木蛋白質含量下降程度最大。

2.2.5.2 接種點數量對苗木韌皮部蛋白質含量影響。

除C59-4外，接種點數量與苗木蛋白質含量呈明顯的負相關。處理后28 d，與CK3相比，CK1-1、CK1-2和CK1-4蛋白質含量分別下降了25.6、31、33.1個百分點，CK2-1、CK2-2和CK2-4分別下降了22.3、36.9、48.3個百分點，C59-1、C59-2分別下降了52.4、75.0個百分點。這表明機械損傷和病原菌絲在韌皮部、木質部管胞和木射線薄壁細胞等組織和細胞內的大量蔓延造成苗木的物質合成和代謝紊亂或阻斷，導致蛋白質含量減少，另一方面溶酶體的破裂加速了蛋白質的降解[14]。試驗中出現了C59-4蛋白質含量下降率低于C59-2的結果，原因可能與接種苗木自身產生免疫蛋白有關。

2.2.6.2 接種點數量對苗木韌皮部MDA含量影響。

接種點數量與苗木MDA含量呈明顯的正相關。處理后28 d，與CK3相比，CK1-1 MDA含量下降了10.6%，CK1-2、CK1-4、CK2-1和CK2-2 MDA含量均增加，但上升幅度不明顯，分別為10.6%、65.8%、16.6%和39.3%。CK2-4 MDA含量上升的幅度較大，為102.2%。C59-1、C59-2、C59-4的MDA含量分別上升了76.1%、139.6%、247.7%；C59的2點、4點接種處理顯著高于1點接種處理。這表明不同程度危害可誘發苗木細胞膜中自由基引起膜脂過氧化作用，使細胞膜損傷的同時造成了過氧化產物MDA的大量產生和不斷累積。

2.2.7 苗木韌皮部脯氨酸的變化。脯氨酸是植物蛋白質的組成成分之一，并以游離態廣泛存在于植物體中[15]。脯氨酸被認為是植物逆境脅迫的產物，在逆境脅迫下植物體內游離脯氨酸積累是一個普遍現象，脯氨酸的含量也可作為植物生理抗逆性指標。植物在正常條件下，游離脯氨酸含量很低，但當遭受逆境脅迫時，游離脯氨酸便會積累，并且積累指數與植物的抗逆性有關。它既可能有適應性意義，又可能是細胞結構和功能受損傷的表現，也有依據說明脯氨酸在逆境脅迫下的積累，是對逆境脅迫的一種適應性反應[16]。也有研究證明，脯氨酸積累與組織內碳水化合物含量有一定關系[17]，植物體內缺水時可導致代謝產物脯氨酸的積累。植株體內脯氨酸含量越高說明越能夠從環境中吸取水分供植株生長之用。

不同處理對苗木韌皮部脯氨酸含量的影響顯著（圖15）。CK3脯氨酸含量最低，CK1、CK2次之，接種C59苗木脯氨酸含量最高。

接種點數量與苗木脯氨酸含量呈明顯的正相關。處理后28 d，與CK3相比，CK1-1、CK1-2、CK1-4韌皮部脯氨酸含量分別增加7.1、16.2和48.4個百分點，CK2-1、CK2-2、CK2-4分別增加12.9、31.7和146.0個百分點，C59-1、C59-2、C59-4分別增加52.8、112.7和331.7個百分點。接種菌株C59苗木的4點接種處理均顯著高于1點、2點接種處理。

上述結果顯示，隨著機械損傷程度的提高，苗木韌皮部脯氨酸含量增加，表明游離脯氨酸含量的積累是對傷害脅迫適應性反應，是誘導抗性機制的一部分。隨著菌株C59接種量的增加，4點接種處理的脯氨酸含量顯著高于1點和2點接種處理，結果可能是細胞結構和功能受損傷的表現。苗木含水量的不斷下降也導致脯氨酸的積累。綜上，由于機械損傷和病原菌的刺激激發了苗木內部的防御機制，使苗木表現出了對逆境脅迫的適應性反應。

另外，試驗結果還顯示相同接種點數的CK2苗木韌皮部脯氨酸含量均高于CK1苗木，可能是無菌培養液對苗木生長和代謝有一定的影響，尚需進一步研究。

3 結論與討論

（1）經形態學與18S rDNA ITS序列分析，將采自黑龍江豐林國家級自然保護區紅皮云杉林內的1株云杉八齒小蠹伴生藍變真菌鑒定為蛇口殼屬真菌（Ophiostoma sp.）。該菌對紅皮云杉苗木具有很強的致病性。

（2）蛇口殼屬（Ophiostoma Syd.& P.Syd.）建于1919 年[18]，是經濟上重要的病原真菌，許多種都能引起木材變色，如O.piliferum（Fr.）Syd.& P.Syd.和O.ips（Rumbold）Nannf.是較普遍的木材變色真菌，O.ulmi（Buisman）Nannf.是榆樹荷蘭病的病原菌，O.aenigmaticum K.Jacobs 是從日本云杉上首次分離到的[19]。目前，我國報道該屬真菌6種，包括3種 [O.abietinum Marm.& Butin、O.davidsonii（Olchow.& I.Reid）H.Solheim 和O.francke-grosmanniae（R.W.Davidson）deHoog & R.J.Scheff.]分離自馬尾松（Pinus massoniana Lamb.）和黑松（Pinus thubergii Parl.）木材，2種[O.pinicola G.H.Zhao（nom.nud.）、O.lignicola（Wollenw.）Goid.]分離自馬尾松藍變木材[20-22]和從云南松（Pinus yunnanensis Franch.）木材中獲得的O.minus（Hedgc.）Syd.& P.Syd.[23]。唐明、葉輝等對蛇口殼目真菌、真菌與蠹蟲的關系進行了研究[24-25]。

（3）科學家已從被云杉八齒小蠢致死的云杉邊材中分離出幾種能引起藍色污斑的真菌。從藍色污斑前沿分離得到常見的2種真菌是Ceratocystis polonica（現名Ophiostoma polonicum）和C.penicillata（現名Ophiostoma penicillata）。接種結果顯示這些真菌能致死健康挪威云杉，在云杉八齒小蠢大發生期，它們是致死云杉的又一因子之一[26]。

（4）菌株C59（Ophiostoma sp.）接入紅皮云杉苗木后，菌絲在韌皮部和木質部內管胞和木射線薄壁細胞等組織和細胞內的大量蔓延，造成苗木物質合成、光合作用和其他代謝紊亂或阻斷，特別是樹木水分和光合作用產物的運輸嚴重受阻，導致針葉的葉綠素降解速率大于合成速率，葉綠素含量不斷減少；韌皮部水分及可溶性糖、蛋白質等營養物質也不斷減少。筆者研究的結果與蒲曉娟2006年在華山松（Pinus armandi）的研究結果相一致。試驗中出現的苗木蛋白質含量隨著真菌接種點的增加、接種量的增大而提高的現象，可能與苗木自身產生免疫蛋白有關。

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