發酵肉制品菌群的非培養鑒定技術研究進展

王穩航　徐倩倩　滕安國　劉安軍

摘 要：隨著分子生物學技術的快速發展，以聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）為基礎的非培養鑒定技術在發酵肉制品菌群鑒定中得到越來越廣泛的應用。其方法主要有種特異性PCR、聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳等。與傳統的分離培養鑒定方法相比，非培養方法具有直接、快速、準確、實時等優點，但同時也存在一些缺點，如樣品復雜程度、DNA（RNA）提取條件、PCR反應過程的差異等均可影響鑒定結果。非培養鑒定技術與傳統微生物鑒定技術相結合，能夠對發酵肉制品菌群多態性和動態變化做出準確的鑒定。

關鍵詞：發酵肉制品；菌群；非培養方法；種特異性聚合酶鏈反應；聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳

Culture Independent Methods for Investigating Microbial Ecology of Fermented Meat

WANG Wen-hang， XU Qian-qian， TENG An-guo， LIU An-jun

（College of Food Engineering and Biotechnology， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China）

Abstract： With the rapid development of molecular biological technology， culture independent methods based on polymerase chain reaction （PCR） technology have an increasing application in the identification of microorganisms in fermented meat. The existing culture independent methods mainly include species specific PCR and PCR-denatured gradient gel electrophoresis/temperature gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE/TGGE）. Compared with traditional culture dependent methods， culture independent methods have some advantages such as direct， rapid， accurate and real-time， but also have disadvantages because the results may be influenced by sample complexity， DNA extraction and PCR reaction. The combined application of culture dependent and culture independent methods may provide the best estimation of polymorphism and dynamic changes of microorganisms in fermented meat.

Key words： fermented meat； microorganisms； culture independent methods； species specific polymerase chain reaction （SS-PCR）； polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis/temperature gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE/TGGE）

中圖分類號：Q93.331 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2014）09-0017-05

自1940年開展自然發酵肉制品菌群的分離鑒定和商業發酵劑的研發以來，發酵肉制品生產得到了快速發展。尤其是近幾年來，歐美一些國家（如意大利、西班牙等）發酵肉制品在肉類制品市場上的份額達到15%以上，占有舉足輕重的地位。

由于傳統自然發酵方式存在生產周期長、產量低、食用安全性差等諸多缺點，加上發酵肉制品市場需求的不斷增大，利用直接添加發酵劑工業化生產發酵肉制品已成為主流。欲制備工業發酵劑，首先要對自然發酵肉制品的菌群進行分離、鑒定，尋找對發酵肉制品品質具有重要貢獻的微生物，然后通過人工培養生產工業發酵劑，再直接添加于鮮肉中生產發酵肉制品。另外，對發酵肉制品生產過程中微生物菌群變化進行動態檢測也是調控肉制品質量的關鍵。因此微生物鑒定技術已成為發酵肉制品生產的重要內容。

根據是否需要對樣品中微生物進行分離培養，微生物鑒定技術可分為培養方法和非培養方法。培養方法鑒定技術即為傳統的微生物鑒定技術，是指將待檢樣品轉接在培養基上，模擬待檢微生物的生長條件，待生成單個菌落后，再對其進行生理生化、分子生物學等指標的檢測，以確定微生物種類。最近十年的研究不斷證明傳統分離培養鑒定技術不能清楚描述發酵食品的微生物菌群的多樣性，也不能對優勢菌群進行準確計數[1]。其主要障礙就是待檢菌種必須進行分離純化后，才能進行生理生化，如革蘭氏染色、乳酸脫氫酶、過氧化物酶、糖發酵種類、二氨基庚二酸、產乳酸特性、精氨酸水解能力等相關檢測實驗。然而理化檢測有時現象不明顯，甚至有時不同菌種之間相互混淆，比如來源于肉制品的彎曲乳桿菌（L. curvatus）和清酒乳桿菌（L. sakei）就不易區分。雖然聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）、核酸探針等分子生物學技術可以部分解決這一問題，但分離培養的繁瑣過程費時費力，一般需要1周以上才能完成，不能對發酵肉制品發酵過程的菌相變化進行有效的實時監控。

培養方法鑒定技術的另一缺陷是這種方法僅適用于一些容易培養的菌株，而對一些進行富集或選擇性培養比較困難的菌株則無法進行鑒定[2]。據估計，自然界中能用于人工培養的微生物種類不超過1%，這也限制了傳統培養鑒定技術的應用[3]。

非培養方法是指不需進行待檢微生物的富集或分離，從樣品中直接分離DNA或RNA，再以分子生物技術手段進行分析鑒定來反映微生物菌群多樣性和動態的一類微生物鑒定技術[4]。這些技術主要采用PCR技術并輔以其他技術為基礎，在鑒定過程中不需進行目標菌的分離純化從而避免了人為因素影響，從而更能快速、準確、科學地反映發酵過程中菌群的多樣性、復雜性和動態變化，尤其是可對不同微生物之間協同、拮抗作用以及對發酵肉制品品質的影響進行綜合性研究[5]。

經過近年來的不斷研究，已發展了多種以PCR反應為基礎的發酵肉制品非培養鑒定技術，主要有種特異性PCR、PCR-變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）/溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）等。

1 種特異性PCR

1.1 種特異性PCR技術原理

PCR技術已經廣泛用于微生物的鑒定和檢測，其主要以16S rRNA和23S rRNA為擴增區域，通過分析其間差異鑒定微生物種類[6]。但在一些相近的種，如L.sakei和L.curvatus，由于它們的rRNA序列的高度相似性，不能利用此種方法進行鑒定，而16S～23S rRNA ITS區間（inter genic transcribed spacer）序列由于進化速度比16S rRNA快10倍以上，不同微生物種間具有較大的堿基差異，因此可用來區分親緣關系較近的菌種。這種根據不同種類微生物基因特定區間差異設計特異性引物，進行PCR擴增進行微生物鑒定的方法稱為種特異性PCR，其能夠有效、快速、準確地進行發酵肉制品菌群的檢測。

1.2 種特異性PCR技術應用

與傳統PCR相比，種特異性PCR更方便、快捷、準確，交叉感染的機會大大降低，并且能夠實現高通量、寬動態、自動化[7]。同時，近十年乳酸菌的基因序列的不斷闡明，為種特異性PCR的引物設計也提供了很大幫助，推動了種特異性PCR的廣泛應用。

Aymerich等[8]根據不同種類微生物設計了12對引物，利用種特異性PCR技術鑒定了西班牙Chorizo香腸和Fuet香腸的乳酸菌（LAB）和凝固酶陰性葡萄球菌（CNS）菌群，并對未富集和富集的2種樣品前處理方法進行比較。結果發現，不通過培養基富集，直接從發酵香腸樣品中提取DNA，L.sakei和L.curvatus檢出率為11.8%，植物乳桿菌（L. plantarum）和木糖葡萄球菌

（S. xylosus）檢出率為17.6%。而通過富集后，L. casei和S. xylosus檢出率為100%，屎腸球菌（E. faecium）檢出率為11.8%。原因可能是樣品中含有干擾物質，抑制了PCR反應，使結果呈陰性。

Marít等[9]利用螯合型離子交換樹脂Chelex100對發酵香腸樣品進行前處理，并設計SakF

（5-GATAAGCGTGAGGTCGATGGTT-3）和SakR

（5-GAGCTAATCCCCCATAATGAAACTAT-3）種特異性引物擴增16S-23S rRNA ITS區域，利用種特異性PCR技術對發酵香腸的L.casei進行了實時動態計數。通過螯合型離子交換樹脂Chelex100處理樣品而不進行DNA純化，PCR擴增結果表明L.casei檢出下限為3個菌/反應，相當于3×103 CFU/g樣品，檢測結果從6×105～32×105個菌/反應范圍內呈線性關系（R2=0.996）。利用這種方法對11 個發酵香腸樣品中L.casei數量進行檢測，結果與MRS平皿計數比較，相對準確度在91.24%～98.16%之間，統計結果表明實時PCR計數與平皿計數結果無顯著差異。上述前處理方法與DNA純化方法相比，除樣品所需菌濃較高外，分析并無其他PCR干擾現象發生，因此這種前處理可有效對發酵香腸菌群進行實時定量。

1.3 種特異性PCR技術優缺點

種特異性PCR的特點是快速、準確、靈敏度高、特異性強。利用種特異性PCR進行微生物鑒定，樣品不需要分離純化，可以在提取DNA（RNA）后直接擴增，利用種屬差異性檢測特定條帶，達到檢測鑒定目的，因而省時省力。另外，根據種屬差異設計特定引物，檢測結果靈敏度、準確度都較高[10]。

但是，種特異性PCR也存在一些缺陷。首先，種特異性PCR和其他PCR一樣，是以現有基因序列為模板進行擴增，因此僅適用于已測得基因序列或清楚相關遺傳信息的微生物的檢測鑒定。同時，由于食品成分復雜，尤其是一些PCR抑制劑的存在，如蛋白酶、血紅素化合物、螯合劑和蛋白質等，均可降低檢測靈敏度。因此，利用種特異性PCR進行菌種鑒定必須進行樣品預處理，如樣品稀釋、離心、過濾、雙水相萃取、吸附、DNA純化等方法來消除發酵香腸中PCR抑制物。另外，采取擴增內標方法可有效避免不同原因造成種特異性PCR反應的假陰性現象[11]。反應體系中加入擴增內標后，擴增內標可與模板DNA同時擴增，若在反應體系中目標序列的濃度較低或不存在時，應該有擴增內標的擴增產物出現，如果PCR反應中沒有產生任何擴增產物，說明反應受到抑制，產生了假陰性，需要重新提取DNA進行PCR反應。

2 PCR-DGGE/TGGE

2.1 PCR-DGGE/TGGE技術原理

PCR-DGGE/TGGE技術最早由Fisher等[12]和Lerman等[13]于1979年提出，是指不同生物DNA特定序列的相同長度PCR擴增產物在各自相應變性劑濃度（變性溫度）下發生空間構型變化，導致產生不同的電泳速度，最后在不同相應位置停止，并經過染色分辨DNA片段差異的電泳技術。

不同微生物的16S rDNA片段長度相同，但序列變化多樣，在經過適當變性后，可停留在DGGE譜圖上的不同位置，進而根據DGGE電泳條帶、相關序列以及16S rDNA基因組資料，從而可以區分和鑒定不同種類微生物。理論上講，對每一種微生物16S rDNA的可變區域進行擴增都會產生一個不同的DGGE圖譜[14-15]，因而可同時檢測多個樣品并可比較不同時間和不同環境的微生物菌群變化情況。

2.2 PCR-DGGE/TGGE技術應用

隨著1993年Muxzyer等[16]首次將DGGE技術應用于微生物生態學研究，PCR-DGGE技術在環境生態、海洋生態、腸道菌群等領域[17-19]的研究中不斷得到應用。最近幾年來，PCR-DGGE技術開始被逐漸應用于發酵食品微生物研究，如用于監測中國鎮江香醋[20]、意大利發酵玉米團[21]、韓國發酵豆醬[22]和日本大米黑醋[23]等的菌群變化。

Cocolin等[24]利用PCR-DGGE技術對發酵香腸的菌群組成及動態變化做了系列研究。首先，對意大利發酵香腸菌群動態變化過程進行監控。通過直接從發酵香腸中提取DNA，設計5對不同引物對16S rRNA的V3、V9、V2-V3、V6-V8、V1、V3等不同區域進行擴增，結果發現只有P1（5-GCGGCGTGCCTAATACATGC）、P2（TTCCCCACGCGTTACTCACC-3）引物擴增的V1區PCR產物才能對Lactobacillus spp.、Staphylococcus spp.、 Kocuria spp.等不同菌種進行有效鑒別，不同種間沒出現共遷移現象。對DGGE濃度的選擇上，發現40%～60%的變性梯度能進行Micrococcaceae和Staphylococcus之間的區分；而30%～50%的變性梯度能進行所有Lactobacillus屬的菌種區分。在發酵過程第1天的DGGE譜圖上出現多個條帶，經過序列分析，大部分為Staphylococcu spp.，從發酵第10天開始，僅有LAB條帶出現，而其中以L.sake和L.curvatus為主，表明香腸發酵過程以LAB為優勢菌種，Micrococcaceae屬僅占次要位置。在發酵香腸中，PCR-DGGE技術的檢測下限為104 CFU/g樣品。

接著，Cocolin等[25]利用DGGE技術研究了新鮮發酵香腸中菌群動態結構。結果發現香腸成熟第1天，僅有L. curvatus出現，隨后在第3天消失；B. thermosphacta在第2天出現，并貫穿整個成熟過程；S. xylosus僅在第3天出現；第6天檢出了L. casei，并且其在以后成熟期保持數量穩定；第10天時檢出了腸膜明串珠菌

（L. mesenteroides）。而以RNA為模板擴增所得DGGE條帶比以DNA為模板擴增所得DGGE條帶豐富得多，除以上細菌外，還出現了多種未知菌。同時，以NL1

（5-GCC ATA TCA ATA AGC GGA GGA AAAG-3）和LS2（5-ATT CCC AAA CAA CTC GAC TC-3）為引物進行PCR擴增，發現了Debaryomyces hansenii和Capronia mansonni等酵母的存在。

Fontanaa等[26]利用Bact-0124f（GC）（5-CACGGATCCGGACGGGTGAGTAACACG-3）-Uni-0515r（5-ATCGTATTACCGCGGCTGCTGCTGGCA-3）引物擴增16S rDNA上V2-V3區域序列，以V3f（GC）（5-CCTACGGGAGGCAGCAG）-Univ-0515r（5-ATCGTATTACCGCGGCTGCTGCTGGCA-3）引物擴增V3區域序列對阿根廷發酵香腸中菌群進行了分析。結果發現，以40%～60%的變性凝膠梯度濃度進行分析結果較好。擴增的V3區在發酵開始時，DGGE譜圖上出現了較多條帶，1～6條帶依次被鑒定為L. plantarum、乳酸片球菌（P.acidilactici）、L.casei、L. curvatus、馬胃葡萄球菌（S.equorum）和腐生葡萄球菌（S.saprophyticus），條帶10被鑒定為C.variabilis。微生物檢出下限為104 CFU/g

樣品。

Cocolin等[27]對商用發酵劑直接發酵香腸過程中的菌群進行檢測。利用DNA為模板對16S rDNA區間序列進行擴增，僅發現L. plantarum和肉葡萄球菌（S.carnosus）存在，而以RNA為模板擴增還發現S.xylosus存在。

2.3 PCR-DGGE/TGGE技術優缺點

PCR-DGGE/TGGE作為一種新興的微生物鑒定技術，具有耗時少，僅需8 h即可完成，結果重現性好，不需分離單個菌落等諸多優點[28-29]，因而能夠同時鑒定大量發酵肉制品樣品微生物組成，并可用于監測發酵過程中微生物群落的動態變化過程，尤其對于一些培養困難或根本不能培養的菌株的鑒定具有很大的應用潛力。

但是，PCR-DGGE/TGGE本身也存在著一些技術缺陷。首先，DGGE/TGGE由于其高分辨率，所分析的DNA片段較小，一般在500個堿基對以下，因此得到的微生物系統信息較少，其次，DGGE/TGGE圖譜中一般只能分辨1～20個條帶，這些條帶大多僅反映微生物群落中的優勢菌群，可能只有占總微生物數量1%以上的種群才能被檢測出來，而弱勢菌群根本不能被檢測到。

另外，樣品菌群的復雜性、核糖體RNA拷貝數、提取純化DNA、PCR擴增等方面的差異，也會對鑒定結果產生影響。理論上，同種微生物的DGGE譜圖應該僅有單一條帶，但實際上可能會出現多個條帶[30]。造成這一現象除與實驗條件有關外，rRNA的多態性也是主要原因之一。同一微生物核糖體基因可能存在多個拷貝，由于這些拷貝呈微觀不均一性，而DGGE技術的高分辨率，導致其16S rRNA擴增呈現多個條帶，因此夸大了微生物菌態的多樣性[31]。Rantsiou等[32]提出了解決這一問題的方案。編碼RNA聚合酶的β亞基的rpoB基因通常僅有一個拷貝，擴增后產物也僅為一條譜帶。其根據rpoB基因設計引物擴增，PCR產物的DGGE圖譜能夠清楚分辨出Lactobacillus、Lactococcus、Enterococcus、Streptococcus、Leuconostoc和Weisella，因此可用這一基因進行復雜發酵樣品（如發酵香腸、奶酪等）微生物菌群的檢測。

3 結 語

非培養鑒定技術具有實時、科學、方便等優點，對發酵肉制品的菌群結構及動態分析具有很大的潛在應用價值，但作為一種新興的鑒定手段，尚未形成統一的方法和程序[33]。一般來說，發酵肉制品的非培養鑒定技術的應用存在3個關鍵點：第一，樣品DNA提取。DNA提取是非培養方法研究中的第一步，也是關鍵的一步，如何高效提取樣品中菌群的DNA顯得至關重要。DNA提取中混雜雜質如蛋白質等會干擾PCR反應，另外樣品中菌群含量過低，或DNA提取過程中損失較大，均可影響最終PCR反應。DNA提取目前沒有統一標準步驟，一般均通過實驗根據不同樣品確定最佳提取條件。第二，特異性引物設計。根據不同微生物種類的DNA/RNA特定區間序列的變化，設計適宜的引物，對檢測結果將起到至關重要的作用。第三，PCR反應和DGGE/TGGE反應條件的選擇。理論上，DGGE譜圖上每一條帶均代表1個不同的物種，但是，由于PCR反應過程中嵌合體、共遷移、異源雙鏈體的存在可能會使實驗結果產生偏差，因此必須根據不同目的確定適當的反應條件。關于DGGE方法常見問題及解決方案，邢德峰等[34]進行了詳細分析與解析。

非培養鑒定技術僅適用于已知DNA（RNA）序列和相關遺傳信息的微生物的快速鑒定，因而不能對未知微生物進行檢測，并且無法對發酵肉制品整個菌群做出系統性分析。因此，非培養方法與傳統的分離培養方法進行結合使用，更有利于反映出發酵過程中菌群多樣性的真實信息。

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