稻瘟病菌MoYpt5蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)

黨謝等

摘 要 稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）共有11個(gè)假定的Rab蛋白家族成員，本文選取了MoYpt51（MGG_06241）和MoYpt52（MGG_01185）進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。通過搜索多個(gè)大型蛋白互作數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)，共得到數(shù)百個(gè)與核心蛋白互作的蛋白和互作對(duì)。利用信息處理技術(shù)和高效制圖平臺(tái)將這些蛋白互作對(duì)構(gòu)建成互作網(wǎng)絡(luò)，得到若干個(gè)具有生物學(xué)意義的模塊。結(jié)果表明，篩選得到的互作蛋白中，有的參與了蛋白降解的泛素途徑（MGG_04053等）、囊泡介導(dǎo)的蛋白胞內(nèi)運(yùn)輸（MGG_01238等），有的在蛋白、染色體的組裝和修飾等過程（MGG_03677等）起重要作用。大部分假定互作蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜上，為其與目標(biāo)蛋白互作提供了空間可能性。

關(guān)鍵詞 稻瘟病菌；MoYpt5蛋白；蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

中圖分類號(hào) Q71；Q291 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

The Prediction of Protein-protein Interaction Network

of MoYpt5 in Magnaporthe oryzae

DANG Xie， CHEN Jian*， LIAN Bi， WANG Zonghua， ZHOU Jie**

School of Life Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract There are 11 putative members of Rab family in Magnaporthe oryzae. MoYpt51（MGG_06241）and MoYpt52（MGG_01185）were chosen to conduct analysis of their protein interaction network by bioinformatics. We acquired hundreds of proteins and interaction-partners which interact with the core protein by searching several large protein interaction databases and references， and got a few significantly biological modules on the base of the technology of bioinformatics analysis and the platform of highly effective charting. The results showed that some（MGG_04053， etc.）of the screened proteins involve in the ubiquitin pathway of protein degradation and the protein transportation processes introduced by vesicles in cells（MGG_01238， etc.）， some（MGG_03677， etc.）play a crucial role in the assembling and modifying processes of proteins and chromosomes. Most of the interaction proteins are localized in the cytoplasm and on the cell membrane which generate a spatial possibility of interacting with targeting proteins.

Key words Magnaporthe oryzae； MoYpt5 protein； Protein-protein interaction network

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.025

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是研究植物病原真菌致病機(jī)理的重要模式生物。隨著水稻和稻瘟病菌基因組測(cè)序完成，人們將分子遺傳學(xué)、功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)等方法相結(jié)合對(duì)水稻和稻瘟病菌之間的互作關(guān)系進(jìn)行更加深入的探索，希望從分子生物學(xué)水平上開辟一條新的防治道路[1]。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Rab5蛋白至少存在著Rab5a、Rab5b和Rab5c 3種形式[2]，釀酒酵母中Rab5（Ypt5）有3個(gè)同源蛋白：Ypt51（Vps21）、Ypt52和Ypt53[3]。Rab5不僅參與細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸和蛋白分選，而且還參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞骨架的構(gòu)建[4-5]，在篩選小鼠巨噬細(xì)胞cDNA文庫時(shí)，Rab5參與并增強(qiáng)了凋亡細(xì)胞被吞噬的過程[6]。Ypt5在胞吞作用過程中起著關(guān)鍵作用，能夠調(diào)節(jié)膜泡的融合、囊泡的運(yùn)輸以及內(nèi)涵體的形成[7-9]。此外，Ypt5還參與酵母的有性交配過程和細(xì)胞形態(tài)建成，其功能的異常會(huì)導(dǎo)致酵母對(duì)鈣離子和鉀離子更加敏感[10]。

和其他小G蛋白一樣，Rab蛋白的功能主要是通過其上游的調(diào)節(jié)蛋白和下游的效應(yīng)蛋白實(shí)現(xiàn)的，因此，尋找Rab蛋白的互作蛋白才能深入地了解Rab蛋白的生物學(xué)功能。本文利用酵母中Ypt51和Ypt52的氨基酸序列在稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源搜索，得到同源性較高的MoYpt51（MGG_06241）和MoYpt52（MGG_01185），建立了稻瘟病菌MoYpt5的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，為篩選病原菌中相互作用蛋白提供一種可借鑒的手段。

1 材料與方法

1.1 所用數(shù)據(jù)庫和生物信息學(xué)軟件

MPID（稻瘟病菌蛋白互作數(shù)據(jù)庫[11]，Http：//bioinformatics.cau.edu.cn/cgi-binzzd-cgi/ppi/mpid.pl）；SGD（釀酒酵母基因組數(shù)據(jù)庫，Http：//www.yeastgenome.org/）BioGRID（生物通用相互作用數(shù)據(jù)庫集[12]），Http：//thebiogrid.org/）；IMEx（國際分子相互作用交換聯(lián)盟，Http：//www.imexconsortium.org/）；Cytoscape軟件。

1.2 生物信息學(xué)分析方法

1.2.1 進(jìn)化分析 以稻瘟病菌MoYpt51（MGG_06241）和MoYpt52（MGG_01185）為靶蛋白在NCBI（Http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫（Http：//www.broadinst—itute.org/annotation/genome/magnaporthe_

comparative/MultiHome.html）中進(jìn)行BLASTP搜索，E值設(shè)為1e-6，并通過保守結(jié)構(gòu)域分析（Http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi.）從而獲得這些蛋白在動(dòng)物、植物以及微生物中的同源蛋白序列。在獲得稻瘟病菌Ypt5蛋白同源序列的基礎(chǔ)上，使用ClutsalX1.83軟件進(jìn)行多重比對(duì)，形成序列多重比對(duì)結(jié)構(gòu)圖，結(jié)合MEGA4.0建立稻瘟病菌MoYpt51和MoYpt52與其他生物同源蛋白間的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的建立 利用Cytoscape軟件及其插件得到預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)的分割模塊，再通過文獻(xiàn)和代謝通路數(shù)據(jù)庫對(duì)模塊的生物學(xué)意義和功能進(jìn)行深入分析，同時(shí)，對(duì)PPI進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，包括網(wǎng)絡(luò)基本參數(shù)、度分布、最短通徑、壓力向心力和聚類系數(shù)等，從而評(píng)估數(shù)據(jù)的可信度和穩(wěn)定性[13]。

1.2.3 互作蛋白的亞細(xì)胞定位分析 本實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞內(nèi)定位預(yù)測(cè)軟件是CELLO（Subcellular localization predictive system），此軟件適用于大部分的真核生物，對(duì)真菌的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度比較高，主要是依據(jù)蛋白序列結(jié)構(gòu)上的特異性，是多種算法和計(jì)算軟件的集合。

1.2.4 結(jié)構(gòu)域搜索和互作驗(yàn)證 利用Pfam（Protein families database）和iPfam（interaction Pfam）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)庫[14]（Http：//pfam.sanger.ac.uk）是以序列多重比對(duì)和隱馬爾可夫模型為基礎(chǔ)蛋白家族和結(jié)構(gòu)域的大型綜合數(shù)據(jù)庫；iPfam（interaction Pfam）數(shù)據(jù)庫是Pfam數(shù)據(jù)庫的蛋白互作子數(shù)據(jù)庫，它描述在PDB中收錄的已觀測(cè)到的DDI（Domain-Domain Interaction）。以PDB中儲(chǔ)存的多結(jié)構(gòu)域蛋白和蛋白復(fù)合物為基礎(chǔ)，計(jì)算結(jié)構(gòu)上足夠接近并能形成相互作用的殘基之間的距離和識(shí)別原子間鍵之范德華力、氫鍵、鹽橋和二硫鍵等的相互作用[15]。然后將先前預(yù)測(cè)得到的稻瘟病菌Ypt5蛋白互作對(duì)的序列信息輸入Pfam數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域的查找和互作分析，從而進(jìn)一步對(duì)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 MoYpt51和MoYpt52進(jìn)化分析

以稻瘟病菌MoYpt51（MGG_06241）為靶蛋白在NCBI和稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源蛋白搜索和BLASTP比對(duì)分析，獲得這些蛋白在動(dòng)物、植物以及微生物中的同源蛋白序列17個(gè)（圖1-A），并從中挑選6個(gè)具有典型意義的稻瘟病菌Ypt5蛋白同源序列，分別為：NcYpt51（XP_964811.1）、AkYpt51（GAA82723.1）、SpYpt51（NP_593907.1）、HsRab5（NP_002859.1）、RnRab5（NP_001099310.2）、ScYpt51（NP_012939.1）。使用Clustal X 1.83軟件形成序列多重比對(duì)結(jié)構(gòu)圖（圖1-B）。

用同樣方法，共找到稻瘟病菌MoYpt52（MGG_01185）同源蛋白14個(gè)（圖2-A），并從中挑選6個(gè)具有典型意義的稻瘟病菌Ypt52蛋白同源序列，分別為：NcYpt52（XP_955952.1）、AcYpt52（XP_001271078.1）、ScYpt52（NP_014732.1）、HsRab5a（NP_004153.2）、MmRab5a（NP_080163.1）、AtRab5a（NP_193699.1），進(jìn)行了多重比對(duì)分析（圖2-B）。

從以上2個(gè)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，MoYpt51和MoYpt52與粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisia）的遺傳距離較近，同源性高。由于在真菌領(lǐng)域?qū)Υ植诿}孢菌研究相對(duì)來說不夠深入，數(shù)據(jù)庫的知識(shí)量偏少，所以在下面基于同源映射搜索蛋白互作對(duì)的過程中，主要選取釀酒酵母作為模式真菌。氨基酸序列比對(duì)表明MoYpt51和MoYpt52都具有G結(jié)構(gòu)域和可變的N端和C端組成。G結(jié)構(gòu)域中具有5個(gè)高度保守的氨基酸序列RabF1-F5，可作為Rab蛋白鑒定的特征序列，4個(gè)保守序列RabSF1-4可作為區(qū)分Rab蛋白亞家族的特征序列。這說明Rab家族蛋白的功能結(jié)構(gòu)域是十分保守的，這為基于蛋白結(jié)構(gòu)域上的互作驗(yàn)證準(zhǔn)確性奠定了基礎(chǔ)。

2.2 MoYpt51和MoYpt52的假定互作蛋白

從MPID數(shù)據(jù)庫中共得到MoYpt51（MGG_06241）的假定互作蛋白8個(gè)，SGD數(shù)據(jù)庫6個(gè)，BioGrid互作數(shù)據(jù)庫27個(gè)，IMEX蛋白互作綜合數(shù)據(jù)庫3個(gè)（表1）。

從MPID數(shù)據(jù)庫中共得到MoYpt52（MGG_01185）的假定互作蛋白共1個(gè)，SGD數(shù)據(jù)庫5個(gè)，BioGrid互作數(shù)據(jù)庫10個(gè)，IMEX蛋白互作綜合數(shù)據(jù)庫1個(gè)（表2）。

通過4個(gè)大型蛋白互作數(shù)據(jù)搜索，得到了上百個(gè)與核心蛋白互作的一級(jí)和二級(jí)互作蛋白（二級(jí)蛋白較多未列出），結(jié)合數(shù)個(gè)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的支持，表明這些互作蛋白之間有某些化學(xué)或者是物理學(xué)之間的互作關(guān)系。

2.3 MoYpt51和MoYpt52的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和亞細(xì)胞定位

進(jìn)一步，本研究建立了MoYpt51（MGG_06241）蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖3-A），該網(wǎng)絡(luò)共涉及到248個(gè)蛋白，652個(gè)互作蛋白對(duì)，其中與核心蛋白MoYpt51互作的一級(jí)蛋白共39個(gè)，其余為二級(jí)互作蛋白208個(gè)。

圖3-B是從圖3-A剝離出來的互作網(wǎng)絡(luò)子圖，此子圖中只有核心蛋白和直接與核心蛋白互作的一級(jí)蛋白，并使用CELLO數(shù)據(jù)庫對(duì)這些互作蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析。MoYpt51蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)[16]，所以位于細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜上的蛋白與其互作的概率較大，這樣的蛋白共有19個(gè)，占一級(jí)互作蛋白總數(shù)的48.7%。

MoYpt52（MGG_01185）互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖4-A）共涉及到144個(gè)蛋白，352個(gè)互作蛋白對(duì)。其中與核心蛋白MoYpt52互作的蛋白共17個(gè)，其余為二級(jí)互作蛋白126個(gè)。

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，MoYpt52蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)（圖4-B），這類蛋白共有10個(gè)，占一級(jí)互作蛋白總數(shù)的58.8%，MoYpt52蛋白互作網(wǎng)絡(luò)里有50%以上的假定互作蛋白在亞細(xì)胞定位上與MoYpt52蛋白有空間上的互作關(guān)聯(lián)。

2.4 MoYpt51和MoYpt52蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的模塊聚類分析

對(duì)MoYpt51蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分割，共得到6個(gè)聚類模塊（圖5A-F），通過代謝通路和文獻(xiàn)分析，模塊A和B中的核心蛋白MGG_04053和MGG_07727以及關(guān)聯(lián)蛋白MGG_00908、MGG_03512、MGG_07031和MGG_00170等都是蛋白泛素降解途徑的重要蛋白；模塊C中的核心蛋白MGG_01238以及關(guān)聯(lián)蛋白MGG_05256和MGG_03283與囊泡介導(dǎo)的蛋白胞內(nèi)運(yùn)輸有關(guān)；模塊D中的核心蛋白MGG_06343和它的互作蛋白MGG_01652、MGG_00904和MGG_07931參與了胞內(nèi)蛋白的折疊過程；模塊E中的4個(gè)蛋白參與了蛋白磷酸化過程，該模塊可能是胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的部分；F模塊含有內(nèi)涵體向高爾基體逆向運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)蛋白MGG_08645，而MGG_04143也是轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，初步推測(cè)該模塊是細(xì)胞內(nèi)吞過程的下游代謝模塊之一。

對(duì)MoYpt52蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分割共得到5個(gè)模塊（圖6A～E），模塊A的核心蛋白MGG_02608以及相關(guān)蛋白MGG_00908、MGG_01380和MGG_

07031等眾多蛋白都參與了蛋白泛素降解途徑，這是從主網(wǎng)絡(luò)中分離的較為完整的蛋白代謝模塊；模塊B中的核心蛋白MGG_01238以及關(guān)聯(lián)蛋白MGG_

05256和MGG_03283與囊泡介導(dǎo)的蛋白胞內(nèi)運(yùn)輸有關(guān)，推測(cè)其為蛋白胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的代謝模塊之一；模塊C中的核心蛋白MGG_06910以及樞紐蛋白MGG_09346與胞內(nèi)蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)過程有關(guān)，這是一個(gè)胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸代謝模塊之一；模塊D中的關(guān)聯(lián)蛋白MGG_04389和MGG_04978預(yù)測(cè)是內(nèi)吞過程中蛋白錨定功能模塊；模塊E中核心蛋白MGG_03677具有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，而其他幾個(gè)關(guān)聯(lián)蛋白與染色體的組裝有關(guān)，該模塊可能參與了染色體的組裝和修飾。

2.5 結(jié)構(gòu)域搜索和互作驗(yàn)證

將互作蛋白的序列數(shù)據(jù)輸入到Pfam數(shù)據(jù)庫中（Http：//pfam.sanger.ac.uk/）得到結(jié)構(gòu)域信息和PfamIDs。在此基礎(chǔ)上利用IPfam和3DID（Http：//3did.irbbarcelona.org/domainquery.html）等結(jié)構(gòu)域互作數(shù)據(jù)庫來驗(yàn)證這些蛋白的互作關(guān)系。結(jié)果表明（表3、4），MoYpt51結(jié)構(gòu)域互作蛋白有7個(gè)，MoYpt52結(jié)構(gòu)域互作蛋白有5個(gè)，所有這些用結(jié)構(gòu)域互作篩選到的蛋白都在先前篩選的互作蛋白庫內(nèi)，這也就說明了研究數(shù)據(jù)的可信性。

3 討論與結(jié)論

3.1 MoYpt51和MoYpt52蛋白互作網(wǎng)絡(luò)特性分析

本文篩選的預(yù)測(cè)蛋白都是通過生物信息學(xué)同源映射方法而來，其數(shù)據(jù)量較大，具有廣闊的篩選空間和一定的可信度。從網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮匦陨峡矗@些互作網(wǎng)絡(luò)與隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)相比具有明顯無尺度網(wǎng)絡(luò)特征和小世界屬性，蛋白間聯(lián)系較為緊密，有一定的模塊聚類特點(diǎn)。利用結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫分析驗(yàn)證了部分具有較高互作可能性的蛋白，這些蛋白都有著若干個(gè)與Ras家族的特定保守結(jié)構(gòu)域G1-G5以及Rab家族的特定基序RabF1-4相互作的特定功能結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步說明了這些蛋白和MoYpt5互作的可能性。

3.2 MoYpt51和MoYpt52蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的驗(yàn)證

酵母相關(guān)研究表明，CORVET復(fù)合物是酵母中Ypt5的效應(yīng)子，而Vps8是CORVET的一個(gè)重要亞基[3，17]，主要參與囊泡的胞內(nèi)運(yùn)輸過程，經(jīng)酵母Vps8同源比對(duì)得到稻瘟病菌中的MGG_01238。Vps9是Ypt51（Vps21）的上游調(diào)節(jié)蛋白鳥苷酸交換因子GEF，對(duì)Vps21的活性起著至關(guān)重要的作用[19]，同源比對(duì)可以得到稻瘟病菌中的MGG_05379。鳥苷酸解離因子（GDI）負(fù)責(zé)將細(xì)胞之中GDP結(jié)合態(tài)的Rab蛋白運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜上面，對(duì)Ypt51的功能循環(huán)起著重要的調(diào)節(jié)作用[20]，稻瘟病菌中的同源蛋白為MGG_07137。這些研究與本文的部分結(jié)果十分契合，進(jìn)一步說明了本文預(yù)測(cè)的互作蛋白可信度。

3.3 MoYpt51和MoYpt52蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)的意義

目前，Rab5/Ypt5多在酵母和人類中進(jìn)行了相關(guān)的功能研究，但至今還未見到稻瘟病菌中對(duì)此類蛋白的報(bào)道。本文分別對(duì)稻瘟病菌MoYpt51和MoYpt52的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了相關(guān)的預(yù)測(cè)，得到了大量的數(shù)據(jù)，包括與MoYpt5互作的蛋白和相關(guān)蛋白的亞細(xì)胞定位，這些結(jié)果和人類以及酵母的Rab5/Ypt5在胞吞、囊泡融合等功能上是相對(duì)應(yīng)的，為研究MoYpt51和MoYpt52的功能關(guān)系、其下游效應(yīng)子的鑒定以及MoYpt5的體內(nèi)互作分子網(wǎng)絡(luò)提供了可行性依據(jù)，為稻瘟病菌的致病機(jī)制以及稻瘟病的防治奠定了理論基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：葉慶亮