金黃色葡萄球菌快速檢測方法的研究進展

張穎

摘要：金黃色葡萄球菌是引起人類細菌性食物中毒及奶牛乳房炎的重要細菌之一，在自然界中廣泛分布。本文將重點介紹金黃色葡萄球菌的幾種快速檢測方法。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌；快速檢測Research Advance on Staphylococcus Aureus Rapid Detection Method Zhang Ying

（Tianjin Animal Disease Prevention and Control Center, Tianjin, 300402）Abstract:Saphylococcus aureus is one of the most important bacterium which can cause bacterial food-poisoning and cow mastitis, it widespreads in nature. A few methods for the rapid detection of staphylococcus aureus are finally introduced.

Keywords: Saphylococcus aureus；rapid detection葡萄球菌屬革蘭氏陽性球菌，廣泛分布于空氣、水、土壤、飼料中，也存在于人、動物的體表、鼻咽喉及腸道,屬于人獸共患病原菌。其中，金黃色葡萄球菌致病力最強，除引起皮膚組織及器官化膿炎癥外，所產生的毒素污染食物，導致食物中毒。近年來，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件頗多。據美國疾控中心報道，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒位居第2位，僅次于大腸桿菌，占整個細菌性食物中毒病例的33%，加拿大則高達45%。同時，金黃色葡萄球菌也是引起奶牛乳房炎的主要致病因子之一，給養殖業造成巨大的經濟損失。

目前，金黃色葡萄球菌的快速檢測方法大致可分為3種：一是快速檢測培養基法；二是免疫學方法；三是以核酸為基礎的分子生物學方法等[1]。

1快速檢測培養基法

1.1顯色培養基檢測

顯色培養基（Chromogenic/Fluorogenic Culture Media）是一類利用微生物自身代謝產生的酶與相應顯色底物反應顯色的原理來檢測微生物的新型培養基，減少了對菌株進行純培養和進一步生化鑒定的步驟[2]。

1974年Dr.Alain研制的CHROMagar Staph aureus（CSA）是以金黃色葡萄球菌的DNA酶和凝固酶為主要標志酶，以甲苯胺藍、甲基綠、吖啶橙和5-溴-4-氯-3吲哚-胸苷-3磷酸等為顯色底物來鑒定該菌的顯色培養基。法國梅里埃公司研制的Baird Parker+Rabbit Plasma Fibrinogen(RPF)培養基，通過培養，生長出的灰色到黑色的且不透明的菌落即為金黃色葡萄球菌，因該培養基中含有兔血漿，所以無需作血漿凝固酶試驗做進一步確認[3]。黃吉城等[4]人曾用該培養基和國標法相比較，總相符率達98%，且檢測時間大大縮短。另外，我國青島海博生物公司也研制出類似產品，現已被廣泛使用。

1.2紙片法

利用金黃色葡萄球菌在培養過程中產生的熱穩定核酸酶與顯色劑反應形成粉紅色環來檢測該菌的存在。

美國3M公司生產的PetrifilmTM金黃色葡萄球菌測試片，該測試片有兩部分組成，一部分是經改良的Baird-Parker培養基，對金黃色葡萄球菌有很強的選擇性，另一部分是含有顯色劑和脫氧核糖核酸（DNA）的反應片。Schoeller[5]曾對食品中金黃色葡萄球菌進行傳統方法和3M紙片法的比較，試驗證明3M紙片的特異性強，檢測時間短。吳仲梁等[6]人曾用該測試片進行食品檢樣，結果顯示，PetrifilmTM檢出率達93.3%。

2 免疫學檢測方法

利用抗原與相應抗體特異性結合為理論基礎進行金黃色葡萄球菌的檢測，操作簡單，特異性強，靈敏度高，適用于大批量樣品的檢測。

2.1酶聯免疫（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）技術

ELISA法是免疫診斷中最常用的方法，在進行金黃色葡萄球菌的檢測中常采用“夾心法”。 Schotte[7]曾報道一種改良的ELISA方法——快速免疫色析手工操作法，能夠在15 min之內檢測500 pg/mL的金黃色葡萄球菌腸毒素。但是ELISA法也存在一些缺陷，試驗中所用到的試劑選擇性高，價格昂貴，易受環境、溫度、時間等條件的影響。

2.2免疫熒光（Immunofluorescence Assay,IFA）技術

根據抗原抗體特異性結合的反應特點，將已知抗體與熒光色素以化學方法結合制成熒光標記物，在特定條件下，使樣品與其發生結合反應，之后在熒光顯微鏡下觀察是否有熒光標記的抗原抗體復合物存在，若存在則證明該樣品含有金黃色葡萄球菌。1991年，Rowe等[8]用免疫熒光法分別達到了檢測出混合樣品中高分子量的金黃色葡萄球菌腸毒素和低分子量的金黃色葡萄球菌腸毒素的目的。2004年，Tim Alefantis[9]開發出一種基于免疫雙抗體夾心熒光法的快速檢測金葡菌腸毒素的方法，相比傳統方法，檢測時間大大縮短，全程需40～50 min。

2.3反向被動乳膠凝集試驗（Reverse Passive Latex Agglutination,RPLA）

RPLA法是采用間接凝集反應的原理，將特異性抗體吸附于乳膠顆粒上，當抗原抗體發生特異性結合時，乳膠發生凝集反應，其凝集程度與待測樣品中細菌含量成正比。法國梅里埃公司的Slidex Staph-kit 在檢測樣品時，20 s即可讀出結果[10]。Trisum 公司的Aureus TsetTM則1 min內可觀察結果[11]。RPLA雖簡單易行，但是致敏的乳膠易發生自凝，從而影響反應的靈敏度，造成檢測結果不準確，另外，該方法只能檢測金黃色葡萄球菌的腸毒素。

3 分子生物學檢測

3.1聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction,PCR）

該方法克服了傳統檢測方法的不足，近年來發展比較迅速且被多種領域所應用。國外最早采用PCR方法從食品中檢測金黃色葡萄球菌的報道是在1991年，WILSON等[12]采用該方法，8 h內即可檢出人工污染的干燥脫脂奶中的金黃色葡萄球菌腸毒素B和C1，靶DNA檢出限達到1 fg（<10個細胞），靈敏度非常高。該方法由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環進行，使目的DNA得以迅速擴增。李秀娟等[13]人曾利用PCR對金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶（nuc）保守區域進行擴增并進行特異性檢測，結果顯示用PCR法檢出的陽性率為37.5%，而傳統細菌分離培養法檢出的陽性率為31.3%。但是，PCR技術也有一些弊病，如試驗費用高，試驗技術要求較高，不適合向基層推廣。

3.2核酸探針技術

該技術具有快速、靈敏、特異性強等優點。Noterman等人最早應用于檢測金黃色葡萄球菌腸毒素的方法。其原理是利用了核苷酸堿基序列互補的原則，用特異的DNA探針通過核酸分子雜交來檢測未知樣品的抗原。近年來，Gene Tark推出檢測金黃色葡萄球菌的探針，采用浸染棒比色法，敏感性達100%，假陽性率為9.3%，人工感染樣品中沒有假陽性結果發生[14]。但是該技術操作也較繁瑣、費時。

3.3基因芯片技術

基因芯片技術是近年來才迅速發展起來的一種反向固相雜交的高新技術，具有高通量、快速、靈敏的特點，其原理是設計一種檢測金黃色葡萄球菌的寡核苷酸探針，以一定方式固定在硝酸膜上，制成基因芯片，利用引物對靶基因進行擴增和標記，并與基因芯片在適當條件下雜交，根據雜交結果鑒定金黃色葡萄球菌是否存在。李秀萍等[15]人曾利用該技術對奶牛乳房炎主要致病菌進行檢測，特異性較好，準確率高，可操作性強，為臨床治療提供有力的依據。

3.4 環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)

該技術通過針對靶基因的6個區域而設計4種特異性引物，利用鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下進行反應，1 h內可完成核酸擴增反應，呈現出LAMP特征性梯狀條帶，擴增結果可通過肉眼觀察判定結果。不需要模板的熱變性、長時間的溫度循環以及繁瑣的電泳等過程，同時也不需要昂貴的儀器設備，快速靈敏，特異性強，成本低，尤其適合大量、即時、現場的病原微生物的檢測，是真正的普及型的核酸檢測方法，易于在基層推廣。2003年開始逐步被用于醫學的臨床檢測，2005年在動物疫病檢測方面有所應用，吳紹強等[16]建立亞洲I型口蹄疫病毒的RT-LAMP檢測方法，采用瓊脂糖凝膠電泳、顏色變化、生成沉淀等現象判定結果，為口蹄疫的現場快速檢測提供了一種更加簡便快速的方法，滿足現場檢疫的需要。楊秋林等[17]應用LAMP技術檢測弓形蟲，顯示出較好的特異性和敏感性。江彥增等[18]利用LAMP方法檢測非洲豬瘟病毒，其靈敏度是OIE標準PCR方法的100倍，并且與其他常見豬DNA病毒無交叉反應。隨著人們對該技術的不斷改良，相信LAMP技術會在各領域充分發揮其作用。■（編輯：狄慧）

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