中國桉樹焦枯病病原菌物種多樣性及致病力初步分析

李國清等

摘 要 為了明確中國桉樹焦枯病病原菌的物種多樣性、生物學特性和致病力強弱，本試驗對在中國報道的桉樹焦枯病病原菌進行了形態學比較，β-tubulin、Histone H3、TEF-1α三段基因系統發育學分析，并測定各病原菌在7個溫度下的菌落生長速度，以及對4個桉樹無性系（DH32-29、廣州1號、廣林4號、OC14）離體葉片的致病力大小。結果表明，到目前為止我國桉樹焦枯病病原菌分屬6個不同的物種，分別是Ca. cerciana、Ca. crousiana、Ca. pauciramosa、Ca. pseudocolhounii、Ca. pseudoreteaudii和Ca. fujianensis。不同病原菌的形態存在一定差異，病原菌分屬于不同的系統發育樹分枝。被測試病原菌的最適生長溫度為20～30 ℃，在5 ℃和35 ℃下均停止生長。被測試的5種桉樹焦枯病病原菌在4個桉樹無性系上的致病力差異顯著，總體致病力強弱順序為：Ca. cerciana > Ca. pauciramosa > Ca. pseudoreteaudii > Ca. crousiana > Ca. fujianensis。桉樹無性系對不同種桉樹焦枯病病原菌的抗性存在顯著差異。研究結果顯示桉樹焦枯病病原菌物種存在多樣性，各病原菌的致病性差異顯著，有針對性地選擇抗特定病原物種的桉樹無性系是解決桉樹焦枯病危害的一條有效途徑。

關鍵詞 麗赤殼屬；帚梗柱孢屬；桉樹人工林；接種；葉焦枯

中圖分類號 S432 文獻標識碼 A

Preliminary Analyses on Diversity and Pathogenicity of

Calonectria spp. on Eucalyptus in China

LI Guoqing1， CHEN Shuaifei1 *， WU Zhihua1， ZHOU Xudong2， XIE Yaojian1

1 China Eucalypt Research Centre， Zhanjiang，Guangdong 524022， China

2 Futura Gene Biotechnology， Xuhui， Shanghai 200235， China

Abstract Calonectria leaf blight caused by Calonectria spp. is a serious disease on Eucalyptus trees in the world. The aims of the study were to clarify the species diversity and pathogenicity of Calonectria spp. on Eucalyptus trees in China. Species diversity of Calonectria were clarified based on comparisons of DNA sequences data of ITS， Histone H3， and TEF-1α gene regions， and combined with the fungal morphological characteristics and culture growth features. Research results indicated that six species of Calonectria were existed， these species included Ca. cerciana， Ca. crousiana， Ca. pauciramosa， Ca. pseudocolhounii， Ca. pseudoreteaudii and Ca. fujianensis. Six species could be distinguished by morphological characteristics. The six species resided in different phylogenetic groups. The culture growth features are different for the tested five Calonectria spp. The optimal growth temperature for Calonectria spp. is 25-30 ℃， no growth at 5 ℃ or 35 ℃. Leaf inoculations showed that all four Eucalyptus clones（Guang 1， Guang 4， DH32-29， OC14）tested were susceptible to infect by five tested Calonectria spp. Significant differences of virulence were observed among five Calonectria spp.， with rank of Ca. cerciana > Ca. pauciramosa > Ca. pseudoreteaudii > Ca. crousiana > Ca. fujianensis. Significant differences of resistances were observed among four tested Eucalyptus clones. The paper revealed that species diversity of Calonectria on Eucalyptus trees in China， and provided prospects to select disease-tolerant planting stock for the disease management of Calonectria leaf blight on Eucalyptus trees in the future.

Key words Calonectria； Cylindrocladium； Eucalyptus plantations； Inoculations； Leaf blight

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.025

桉樹（Eucalyptus spp.）作為世界公認的三大速生樹種之一，在我國已成為南方發展速生豐產林的戰略性樹種[1]。近10年來，我國桉樹人工林面積已由154萬hm2（2000年）上升到了368萬hm2（2010年），桉樹給我國帶來了巨大的經濟、生態和社會效益[2-3]。但是，隨著我國桉樹純林面積的增加，桉樹人工林受病蟲害的威脅也越來越大，人工林的不穩定性也急劇增強[3]。

桉樹焦枯病是一種由Calonectria（Ca.）屬真菌引起的世界性重大病害，嚴重影響桉樹的健康生長[4-12]。其病原隸屬于子囊菌門（Ascomycota），糞殼菌綱（Sordariomycetes），肉座菌目（Hypocreales），叢赤殼科（Nectriaceae），麗赤殼屬（Calonectria）；無性階段屬帚梗柱孢屬（Cylindrocladium）[2，10-12]。對于桉樹焦枯病病原菌的命名，一直以來采用雙拉丁學名（有性屬名Calonectria，無性屬名Cylindrocladium），根據近來國際真菌命名的共識：“一種真菌，一個名稱”原則[13-15]，Lombard等[12，16]對Calonectria屬真菌進行了分子、形態以及生物學的系統研究，選擇1867年建立的有性屬名Calonectria代替1892年建立的無性屬名Cylindrocladium來統一表述此屬真菌。本研究也采用這一觀點。

據報道，桉樹焦枯病病原廣泛的分布于我國廣西、廣東、海南、福建等省份的桉樹人工林[6，17-23]。目前在我國廣東、福建已報道的桉樹焦枯病病原菌有6種，其中在廣東發現的有Ca. cerciana、Ca. pauciramosa、Ca. pseudoreteaudii，在福建發現的有Ca. crousiana、Ca. fujianensis、Ca. pauciramosa、Ca. pseudocolhounii[6，23]。

桉樹焦枯病給我國桉樹人工林的健康可持續發展帶來一定威脅[5，24，25]，在1996年桉樹焦枯病就已被列入到國內森林植物檢疫對象。據估計，僅我國福建省平均每年由于桉樹焦枯病造成的損失就達0.518億元[24]，對桉樹焦枯病防控的研究需要加強。選育抗病桉樹無性系是焦枯病防控的最有效措施之一，陳帥飛等[6]的研究結果表明不同桉樹無性系對同一種焦枯病原菌抗性存在顯著差異。在明確桉樹焦枯病病原物種多樣性的基礎上測試病原菌的致病性對抗病桉樹無性系的選育具有重要意義，而相關研究在我國十分有限。本研究主要通過分子生物學方法及形態學方法結合病原的生物學特性對我國桉樹焦枯病不同病原菌進行比較分析，討論病原的物種多樣性，并對不同桉樹無性系進行不同病原菌的致病力測試，以期為桉樹焦枯病病原菌研究及病害防控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

桉樹焦枯病病原菌包括到目前為止在我國桉樹上發現和鑒定的所有6個Calonectria種，菌株包括各個Calonectria種的正模標本菌株，菌株來自于國家林業局桉樹研究開發中心（China Eucalypt Research Centre）森林健康課題組菌種保藏庫（CERC）和南非比勒陀利亞大學-林農生物技術研究所（Forestry and Agricultural Biotechnology Institute）菌種保藏中心（CMW）（表1）。

桉樹組培苗DH32-29（E. urophylla × E. grandis）、廣州1號（E. urophylla × E. tereticornis）由南方國家級林木種苗示范基地提供，廣林4號（E. urophylla×E. grandis）、OC14（父母本未明）由廣西斯道拉恩索林業有限公司提供。桉樹苗高40 cm左右，長勢健壯，無病蟲害。

2% MEA培養基（20 g麥芽粉，20 g瓊脂，1 L水）。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌形態學分析 通過查閱中外文獻，并結合Lombard等[23]和陳帥飛等[6]的研究結果，綜合比較分析我國桉樹焦枯病病原菌結構和形態特征。比較分析的對象包括各Calonectria種的有性階段和無性階段的微觀結構，主要包括子囊類型、囊泡形狀、有性孢子和無性孢子的大小等典型特征。

1.2.2 病原菌系統發育學分析 本研究選用34株桉樹焦枯病病原菌（表1），從GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）上下載供試菌株的3對基因序列β-微管蛋白（β-tubulin）、組蛋白H3（Histone H3）及翻譯延伸因子TEF-1α（translation elongation factor-1α），用BioEdit和Mega4.0進行序列拼接并手動調整，用PAUP4.01軟件以Ca. colombiensis為外群構建ML（Maximum likelihood，最大似然法）系統發育樹，其中Bootstrap檢驗的重復次數為1 000次。

1.2.3 菌落生長速度測定 將25 ℃下MEA平板上培養一周的病原菌用5 mm打孔器取菌餅（含菌落的培養基）正面朝下轉接于2% MEA平板上，設置5、10、15、20、25、30、35 ℃ 7個溫度梯度，每個病原菌轉接3個平板。相同條件下培養7 d，采用十字交叉法測量菌落直徑；為保證試驗的可靠性，整個試驗在相同條件下重復1次。

1.2.4 致病力測試 試驗采用Ca. cerciana（CMW25290，CMW25309）、Ca. crousiana（CMW27249，CMW27253）、Ca. fujianensis（CMW27254，CMW27257）、Ca. pauciramosa（CMW25283，CMW25311，CMW27199，CMW27203）和Ca. pseudoreteaudii（CMW25292，CMW25310）5種致病菌共12株菌對4個桉樹無性系（DH32-29、廣州1號、廣林4號、OC14）進行致病力測定。

（1）病菌培養。將病原菌轉接至2% MEA培養基上，室溫培養1周待用；

（2）離體葉片的采集。4個桉樹無性系組培苗放置于陰棚中1個月，使之保持健康生長。采集的葉片用5%的漂白水表面消毒3 min，清水沖洗3次，然后背面朝上平放于底部有少許清水的保鮮盒隔離墊上；

（3）接種方法。用5 mm打孔器取病原菌菌餅，菌絲朝下放置于葉片上，然后噴灑少許清水使菌餅與葉片充分接觸。每株菌接種5片葉子，以無菌的5 mm 2% MEA培養基菌餅作為負對照；

（4）保持室內溫度30 ℃、濕度70%，處理4 d后測量并記錄病斑長度；

（5）為保證試驗的可靠性，整個試驗在相同條件下重復1次。

1.3 數據分析

采用SPSS 19.0、SAS 9.3、Excel進行方差分析和數據處理。

2 結果與分析

2.1 病原菌形態學分析

在我國發現的6種桉樹焦枯病病原菌形態特征比較詳見表2。從表2可以看出，6個桉樹焦枯病病原物種之間的形態存在明顯差異。如：Ca. cerciana（囊泡紡錘形或倒梨形）和Ca. pauciramosa（囊泡橢圓形）可以通過囊泡的形狀與其他4個種（Ca. crousiana，Ca. fujianensis，Ca. pseudocolhounii，Ca. pseudoreteaudii：囊泡棍棒狀）區分開來。6個種的分生孢子也存在一定的差異，如Ca. cerciana的大分生孢子（av.=44 μm × 4 μm）最小，而Ca. pseudoreteaudii的大分生孢子（av.=104 μm × 8 μm）最大，兩者大分生孢子長度相差60 μm。而對于在無性階段中非常相似的Ca. crousiana（子囊8-孢子）和Ca. pseudocolhounii（子囊4-孢子），它們的子囊類型差異很大。

2.2 病原菌系統發育學分析

34株桉樹焦枯病病原菌的三段基因序列拼接后構建的ML系統發育樹見圖1。由圖1可以看出，6種病原菌分別聚為4個組，Ca. pauciramosa和Ca. cerciana被歸類到Ca. pauciramosa物種組合體中，支持率（Bootstrap value）為97%，Ca. pseudocolhounii和Ca. fujianensis被歸類到Ca. colhounii物種組合體中，支持率為100%；Ca. pseudoreteaudii被歸類到Ca. reteaudii物種組合體中，支持率為100%；Ca. crousiana獨立于其他組合體之外，支持率為100%。其中，Ca. pseudoreteaudii與Ca. reteaudii親緣關系密切，其支持率為58%，其余5種病原菌被聚為單分支的支持率均在93%～100%之間。

2.3 不同溫度對菌落生長的影響

7個溫度梯度下桉樹焦枯病病原菌菌落直徑差異見表3。結果表明，桉樹焦枯病病原菌的生長溫度范圍為10～30 ℃，最適宜生長的溫度范圍為20～30 ℃，10 ℃、15 ℃下生長明顯受到抑制，5 ℃和35 ℃下均停止生長；不同溫度下5種病原菌的生長速度存在差異（表3）。

對各菌株在各溫度下的所有處理進行SAS單因素方差分析可知，同種病原菌在不同溫度條件下生長速度差異顯著，不同種病原菌在同一溫度下的生長速度也存在差異（表3）。不同種病原菌的最適生長溫度也有所差異（除Ca. pseudoreteadii為30 ℃外，其余均為25 ℃）。在最適生長溫度下，Ca. cerciana的生長最快，Ca. pseudoreteaudii最慢。通過SPSS雙因素（菌株和溫度）方差建模分析（調整后的決定系數R2=0.938）可知，菌株和溫度各自對菌落直徑大小的影響顯著（p<0.001），菌株和溫度之間的交互作用顯著（p<0.001）。

2.4 致病力測定

致病力測定結果顯示，在接種24 h后，部分桉樹無性系葉片上開始產生病斑；4 d后，4個無性系均產生病斑，對照無病斑。5種桉樹焦枯病病原菌對4個桉樹無性系的致病力結果以及各菌株在各無性系上的所有處理進行SPSS單因素方差分析結果見表4。

在無性系OC14上，CMW25309[Ca. cerciana，（5.70±0.17）cm]病斑平均長度最大，CMW27254（Ca. fujianensis）、CMW27257（Ca. fujianensis）、CMW25283（Ca. pauciramosa）與對照組相比差異不顯著；在廣4上，CMW25309[Ca. cerciana，（5.23±0.15）cm]病斑平均長度最大，CMW27254（Ca. fujianensis）、CMW27257（Ca. fujianensis）、CMW25283（Ca. pauciramosa）與對照組相比差異不顯著；在廣1上，CMW25309[Ca. cerciana，（3.72±0.11）cm]病斑平均長度最大，CMW27253（Ca. crousiana）、（Ca. fujianensis）、CMW27257（Ca. fujianensis）、CMW25283（Ca. pauciramosa）、CMW27199（Ca. pauciramosa）與對照組相比差異不顯著；在DH32-29上，CMW25311[Ca. pauciramosa，（4.93±0.27）cm]病斑平均長度最大，CMW27254（Ca. fujianensis）、CMW25283（Ca. pauciramosa）與對照組相比差異不顯著（表4）。

5種桉樹焦枯病病原菌在4個桉樹無性系均能產生病斑，Ca. cerciana、Ca. pauciramosa、Ca. pseudoreteaudii、Ca. crousiana產生病斑的長度均與對照組存在顯著性差異，而Ca. fujianensis與對照組差異不顯著；除Ca. cerciana在4個無性系上產生病斑長度有顯著差異外，其余4種病原菌在4個無性系上產生的病斑長度無顯著差異（表4，圖2）。

綜合5種致病菌在4個桉樹無性系上產生病斑的大小，表明5種Calonectria spp. 致病菌的致病性強弱順序是：Ca. cerciana > Ca. pseudoreteaudii > Ca. pauciramosa > Ca. crousiana > Ca. fujianensis，其中Ca. fujianensis與對照組差異不顯著（表4，圖3）。

綜合分析本試驗4個桉樹無性系對5種桉樹焦枯病致病菌的抗性，廣1抗性顯著強于其余3個無性系（表4，圖4）。

通過SPSS雙因素（菌株和無性系）方差建模分析可知（調整后的決定系數R2=0.854），菌株和無性系各自對病斑長度的影響顯著（p<0.001），菌株和無性系的交互作用顯著（p<0.001）。

3 討論與結論

本研究通過對我國不同桉樹焦枯病病原菌的形態學比較，基于多基因片斷的系統發育分析，結合病原菌在不同溫度下的生長特征證明了我國桉樹焦枯病病原物種的多樣性。致病力測試試驗結果表明不同桉樹焦枯病病原物種對同一桉樹無性系的致病性存在顯著差異，不同桉樹無性系對同一病原菌的抗病性的差異。

真菌形態特征是了解病原真菌的最直觀途徑，是病原真菌鑒定分類的關鍵手段。本研究結果表明：在我國發現的6個不同種的麗赤殼屬真菌，它們子囊的顏色和結構、囊泡的形狀、有性和無性孢子的大小存在一定差異。真菌形態結構易受到外界環境條件的影響。現階段分子生物學的興起為病原菌的鑒定分類提供了可靠保障。近年來，借助多基因序列的分子系統發育分析，輔助形態學比較分析為林木真菌的鑒定分類提供了一條可行且比較客觀的途徑。運用此方法，Lombard等[16]和陳帥飛等[6]把桉樹焦枯病致病菌所屬的麗赤殼屬真菌歸類為71個種。因此，未來基于多基因序列的分子系統發育分析結合形態學比較分析將在麗赤殼屬真菌以及其他林木病原真菌的鑒定分類上繼續發揮重要作用。

溫度的高低影響到桉樹焦枯病菌的生長和對桉樹的侵染。研究不同溫度對病原菌生長的影響能幫助預測病害發生和流行的時間。陳英[25]對1種桉樹焦枯病病原菌（Ca. reteaudii）研究結果表明，病原菌的最適生長溫度為25 ℃，10 ℃、40 ℃下停止生長，這與本研究結果部分內容一致，但是本研究對5種病原菌菌絲生長溫度發現，10 ℃下部分病原菌停止生長，但是部分病原菌仍能生長，35 ℃下均停止生長。本研究結果表明：在桉樹焦枯病病原菌的最適宜生長溫度范圍內，須對焦枯病的發生和流行提高警惕，并采取防范措施。在低溫下焦枯病菌生長明顯受到抑制，但是Ca. cerciana、Ca. pauciramosa、Ca. crousiana、Ca. fujianensis仍能致病，這表明焦枯病菌具有很強的溫度適應性，這可能是桉樹焦枯病病原菌破壞性比較大的原因之一。

陳全助[26]通過桉樹焦枯病發病程度的野外調查發現，不同的桉樹種系對桉樹焦枯病的抗病能力有一定差異，陳帥飛等[6]對不同種桉樹焦枯病病原菌致病力試驗結果表明，不同病原菌對不同桉樹無性系的致病力存在差異，這與本研究結果一致。

對桉樹焦枯病病原菌進行準確鑒定分類是研究桉樹焦枯病致病機理以及防控桉樹焦枯病的基礎。本研究證明不同桉樹焦枯病菌的生物學特性、致病性等均有不同，因此不能籠統的把它們作為一個物種來研究。桉樹焦枯病病原的物種多樣性比較高[6，23，27]，在我國僅廣東、福建兩省就已發現6種病原[6，23]，由于我國各個省份的氣候、桉樹品系等存在一定差異，在其他桉樹焦枯病嚴重發病的區域，焦枯病原菌可能存在物種多樣性。有針對性的選擇抗病的桉樹無性系是防控桉樹焦枯病的一條有效途徑。本試驗結果表明：5種病原菌在離體葉片上均能造成病斑，對4種桉樹無性系的致病力差異明顯，因此，有必要對我國桉樹主要種植區域進行廣泛的調查采樣，進行桉樹焦枯病病原的鑒定分類以及病原菌的分布研究，掌握不同區域的優勢病原菌，進而在不同區域通過病原菌在不同桉樹無性系上的致病力測試來選育抗病桉樹品系，這對桉樹焦枯病的綜合防控具有重大意義。

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責任編輯：沈德發