細胞分裂素對紅掌愈傷組織不定芽分化與增殖的影響

王晶等

摘要 [目的]研究細胞分裂素對紅掌組培苗繁殖速度及質量的影響。[方法] 以繼代培養第6代的愈傷組織為試驗材料，探討了ZT、TDZ、6BA 3種細胞分裂素及其濃度對不定芽分化及變異的影響。[結果]在使用濃度2.0～8.0 mg/L的范圍內，隨著細胞分裂素濃度的增加，正常不定芽的分化數及葉片數呈下降趨勢，而異常不定芽分化逐漸增多，且隨著培養時間的延長，這種影響變得更加明顯；3種細胞分裂素的培養效果具有顯著差異，ZT和6BA添加濃度分別在2.0和 4.0 mg/L以下時，其正常不定芽分化較多，不良變異率較少，而TDZ在0.5 mg/L時已顯著抑制了正常不定芽的分化，同時易產生異常不定芽。[結論]3種細胞分裂素作用的強弱依次為TDZ>ZT>6BA；在紅掌愈傷組織繼代培養誘導不定芽過程中，應避免使用高濃度細胞分裂素。

關鍵詞 紅掌；細胞分裂素；不定芽；分化；變異

中圖分類號 S188 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）20-06542-04

紅掌（Anthurium andraeaum），又名花燭、安祖花，為天南星科花燭屬多年生常綠草本植物[1]，因其花型奇特、花色艷麗、花期長而備受人們關注，目前已在國內外花卉市場上占據重要地位。目前紅掌種苗生產已采用大規模的組培快繁技術，但與其他無性繁殖方法相比，在組培生產過程中，由于再生途徑的不同而產生不同程度的變異[2]，如果過于追求繁殖速度，也會影響到苗木的品質，如出現組培苗玻璃化[3]、脫毒不完全[4]、體細胞無性系變異[5]等現象。研究表明，培養環境、激素條件、培養代數都會影響組培苗的變異等品質相關指標，黃小榮等[6]在采用組織培養技術保存金花茶種質資源過程中，前3年未發現明顯變異現象，之后陸續出現外植體退化和死亡。而不合理的使用激素往往帶來更為嚴重的后果，高紅兵等[7]研究表明，當培養基中6BA濃度為0.5 mg/L 時，組培苗未出現玻璃化苗；當培養基中6BA濃度為3.0 mg/L時，組培苗玻璃化率高達95%。王玲等[8]研究表明，在一定濃度范圍內，添加6BA能夠促進蝴蝶蘭花梗腋芽的增殖，但升高到10.0 mg/L時，個別芽出現變異情況。可見在愈傷組織培養過程中，在不合理的激素條件下，對繁殖系數與壯苗率等技術指標產生不良的影響。

激素條件在植物組織培養過程中發揮著重要作用，為了從質量上保證組培苗，筆者研究不同細胞分裂素對紅掌愈傷組織不定芽分化的影響，以期為紅掌組培過程中細胞分裂素的使用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試紅掌品種為紅色系盆栽品種，購自蘇州市花卉市場（編號為YNG01）。選取經葉片培養誘導的、繼代培養第6代的愈傷組織，切除已分化出的芽，保留未完全分化的芽點，切成直徑約2 cm的愈傷組織塊為外植體用于試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計。

根據對前人研究結果[9]的分析，以1/2MS+NAA 0.1 mg/L為基本培養基，細胞分裂素選用ZT、TDZ、6BA，添加濃度均設為0.5、2.0、4.0和 8.0 mg/L 4個濃度梯度，添加蔗糖3%、瓊脂粉0.7%，pH為5.8。每組處理12瓶，每瓶接種3個外植體，每組重復3次。接種后置于培養架上，培養溫度為（25±2）℃，光照時間為12 h/d，光照強度為1 500～2 000 lx，分別在培養30和60 d后進行調查。

1.2.2 調查內容與方法。30 d后剔除污染瓶數，取出50%的外植體用于不定芽分化狀況的調查：①統計正常不定芽的分化數、葉片生長數；②觀察不定芽的莖色、葉色以及葉片形態特征等；③統計異常不定芽數，其中包括生長點異常：不定芽無生長點；葉形異常：葉片呈勺型、狹長、扭曲等畸形；色素異常：幼葉或幼莖由正常的紅色變為綠色（其中全株變綠、生長良好的稱為綠色變異株）。

另50%外植體轉入相同培養基中，繼代培養30 d后再次調查、統計上述性狀。

1.3 數據處理

根據調查的不定芽分化數、葉片數、各種形態變異的不定芽數，利用Excel進行統計與分析，其中變異率 = 各種形態變異不定芽數 /（正常不定芽數+異常不定芽數）×100%。

2 結果與分析

2.1 細胞分裂素對紅掌愈傷組織不定芽分化及生長的影響

2.1.1 細胞分裂素對紅掌愈傷組織不定芽分化的影響。由圖1～3可知，隨著ZT、TDZ添加濃度的增加，正常不定芽的分化數呈減少趨勢。繼代培養30 d時，ZT濃度達到8.0 mg/L時，不定芽分化數下降非常明顯；6BA區的不定芽分化數則呈先增加后減少的趨勢，在2.0 mg/L時，不定芽分化數達到15.75個，高于ZT和TDZ區，而在8.0 mg/L條件下急劇下降到3.25個，可見在0.5～4.0 mg/L的濃度范圍內，6BA對愈傷組織的再分化都有很好的促進作用。與ZT、6BA不同，TDZ區不定芽分化數的下降幅度較小，但其不定芽分化數始終處于較低水平，可能是TDZ有非常強的細胞分裂素活性，這與李浚明[10]的研究結果一致，認為TDZ的使用濃度比其他細胞分裂素要低得多，通常在0.002～0.200 mg/L。

繼代培養60 d后，3種細胞分裂素的培養效果顯示上述相同的變化趨勢。

2.1.2 細胞分裂素對紅掌愈傷組織不定芽生長的影響。由圖4～6可知，不同細胞分裂素對不定芽葉片生長的影響與不定芽的趨勢較一致，葉片數隨著ZT、TDZ添加濃度的增加而減少，而6BA則顯示先增加后下降的變化趨勢，在超過4.0 mg/L時會產生抑制作用。綜合來看，在紅掌愈傷組織繼代培養過程中，細胞分裂素ZT在2.0 mg/L以下、6BA在4.0 mg/L以下時，對紅掌愈傷組織不定芽分化及其生長具有促進作用，過高濃度將不利于不定芽的分化與生長。而TDZ的使用濃度應更低，該研究中0.5 mg/L時就已抑制了不定芽的分化及生長。

圖4 細胞分裂素ZT對正常不定芽葉片數的影響

圖5 細胞分裂素TDZ對不定芽葉片數的影響

圖6 細胞分裂素6BA對不定芽葉片數的影響

2.2 細胞分裂素對紅掌愈傷組織不定芽形態變異的影響

供試紅掌品種YNG01的正常試管苗幼莖為紅色；葉片幼嫩時綠中帶紅，成熟后變為深綠。為了分析細胞分裂素對不定芽變異的影響，首先以幼莖及嫩葉作為調查對象，將莖色和葉色各分為3個等級：不定芽的莖色正常者（紅色）為3級，莖色嵌合、偏紅稍帶綠色者為2級，莖色嵌合、偏綠帶紅色者為1級；葉色正常者（深綠有光澤）為3級，葉片綠色者為2級，葉色黃綠者為1級（圖7）。

圖7 紅掌不定芽莖色、葉色差異與分級

供試品種正常試管苗的葉片為心形，有光澤（圖8a）。但在繼代培養過程中，還觀察到多種類型的異常不定芽，如沒有生長點，雖然著生1～3片葉，但其節間極短，幾乎無伸長生長（圖8b）。異常不定芽的另一種形態表現為葉片畸形，如勺型（圖8d，葉片不伸展，呈勺形）、狹長（圖8-e，心形葉較正常細長）、扭曲（圖8f，葉片不伸展，葉緣扭曲）。通過調查、分析上述異常不定芽的發生情況，判斷細胞分裂素種類及濃度對紅掌愈傷組織再分化的影響程度。

2.2.1 細胞分裂素對不定芽葉色、莖色的影響。

在紅掌愈傷組織繼代培養誘導分化的不定芽中，不同種類及濃度的細胞分裂素對莖、葉顏色的影響存在顯著差異。由圖9可知，繼代培養30 d后，細胞分裂素添加濃度較高時，紅掌不定芽莖色的紅色變淡、變綠，3種細胞分裂素都表現相同的傾向，ZT濃度從0.5 mg/L上升到8.0 mg/L時，莖色指數從3.0下降到1.6；6BA濃度從0.5 mg/L上升到8.0 mg/L時，莖色指數從3.0下降到1.75；在使用細胞分裂素TDZ的情況下，莖色指數顯著低于ZT與6BA。可見ZT的作用效果略高于6BA，而TDZ的作用最強；繼代培養60 d后，莖色指數進一步下降。

由圖10可知，細胞分裂素對葉色的影響與莖色基本一致，葉色指數表現為ZT、6BA >TDZ，且隨使用濃度的增加而下降，繼代培養30 d 與6 0 d之間差異不大。可見高濃度細胞分裂素不利于組培苗的正常生長，甚至引起莖色、葉色的變化，從而降低組培苗的質量。因此，在紅掌愈傷組織再分化培養過程中，應避免使用活性較強或高濃度的細胞分裂素。

2.2.2 細胞分裂素對不定芽生長點的影響。

3種細胞分裂素的使用濃度設置為0.5、2.0、4.0和8.0 mg/L，紅掌愈傷組織繼代培養的不定芽分化數較多，但同時觀察到異常不定芽的發生率也較高，且隨著使用濃度的增加而呈上升趨勢。由表1可知，繼代培養60 d后，當ZT濃度從0.5 mg/L增加到8.0 mg/L，無生長點的異常不定芽發生率從0.54%上升到41.97%，TDZ區由57.14%急劇上升到了84.93%，6BA區的發生率也達到43.64%。

2.2.3 細胞分裂素對不定芽葉形變異的影響。

與生長點異常相比，畸形葉的發生率較低，但隨著3種細胞分裂素濃度的增加，葉形變異率呈上升趨勢。繼代培養60 d后，在ZT、6BA 濃度為8.0 mg/L 時，葉形變異率也分別達到10.47%和18.93%；而TDZ各濃度條件下的畸葉率都較高，可能是激素使用量過高造成的。

2.2.4 細胞分裂素作用與綠色變異株的發生。

供試品種正常組培苗的莖與嫩葉都呈現紅色，但在繼代培養過程中，從ZT和TDZ低濃度區、6BA高濃度區還發現了一類綠色變異株（圖8c），其全株莖、葉都呈綠色，株型及生長狀態良好，且在后續繼代培養過程中能夠穩定遺傳，可以認為這是一種體細胞無性系變異，稱其為綠色變異株（表1），這類變異在新品種選育或種質資源研究中具有一定的應用價值。

3 結論與討論

在紅掌愈傷組織繼代增殖過程中，適宜的激素條件既有利于愈傷組織的不定芽分化，又會促進不定芽的生長發育，因此需要掌握細胞分裂素的使用濃度。該研究結果表明，在紅掌愈傷組織繼代培養過程中，ZT的使用濃度應在2.0 mg/L以下，TDZ的使用范圍要低于0.5 mg/L，6BA的使用濃度也要低于4.0 mg/L。若細胞分裂素的濃度過高，則異常不定芽的發生率就會增加，且隨著培養時間的延長而加劇，使得分化的不定芽大多呈無生長點或畸形葉形態，這與趙斌等[11]的研究有相同之處，其認為當6BA濃度大于2.0 mg/L時，不定芽分化率雖然有所上升，但分化出的不定芽矮小，且生長緩慢。對于這些異常不定芽，若轉入低濃度都適宜繼代培養基后能否恢復正常形態還有待進一步研究。

綜合該試驗結果，可以認為3種細胞分裂素的作用依次為TDZ > ZT > 6BA，這種差異可以體現在不定芽分化數、莖色、葉色及葉形等方面。如TDZ濃度在0.5 mg/L 時，分化形成的不定芽莖色、葉色已發生了顯著變化，ZT濃度高于2.0 mg/L 時會產生不良影響，而6BA高于4.0 mg/L 才形成較多的異常不定芽，這與前人的研究結果[2]，即細胞分裂素的作用為TDZ > ZT > 2ip > 6BA > KT是一致的，而在紅掌組織培養中此前尚少報道。TDZ是一種高效細胞分裂素，在較短時間內能有效促進植株再生[12]，因此在紅掌愈傷組織增殖培養中應避免使用TDZ與高濃度激素，以利于提高組培苗品質。

高濃度的細胞分裂素往往會加劇紅掌異常不定芽的分化，且大多為不良變異，但也獲得了莖、葉發生綠色變異而生長良好的綠色變異株，由于在后續繼代培養中能夠穩定遺傳，因此是一種體細胞無性系變異。對此前人也有類似的報道，如丁愛萍等[13]在紅掌盆栽品種‘AvoGloria的組培苗中發現，在MS+2，4D 0.2 mg/L+6BA 8～10 mg/L 的脫分化培養基上培養后，經MS+NAA 0.2 mg/L+6BA 2.0 mg/L 繼代培養時，可產生3%～7%的紅葉變異，可能也是與初代培養時高濃度的激素條件有關，且經過長期繼代培養之后，再生植株中出現變異的可能性更大[14]。因此，對于上述綠色變異株的遺傳穩定性還需要進一步觀察、分析。