甘藍型黑籽油菜遺傳轉化中預培養環節的優化

林吶　劉梅　丁凌

摘要 [目的]對甘藍型黑籽油菜遺傳轉化中預培養環節進行優化。[方法]利用甘藍型黑籽油菜下胚軸為外植體，對油菜下胚軸的預培養及其浸染后影響再生和分化情況進行研究，分別從苗齡、激素兩方面討論了下胚軸再生與分化頻率的影響。[結果]苗齡、激素與遺傳轉化之間存在密切的聯系。在農桿菌介導的油菜下胚軸預培養最佳體系是：4 d苗齡的外植體在農桿菌侵染前進行5 d預培養，預培養基是MS+2，4D 1.0 mg/L+ 6BA 4.0 mg/L。綠色抗性愈傷組織獲得GUS瞬時表達，PCR鑒定再生植株為轉基因植株。[結論] 該研究獲得了最佳的預培養條件，為建立一個高效的遺傳轉化體系奠定基礎。

關鍵詞 甘藍型油菜；遺傳轉化；預培養

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）20-06556-04

近幾十年來，隨著分子生物學和生物技術的飛速發展，遺傳轉化技術在培育油菜新品種中應用越來越廣泛。而影響遺傳轉化技術的一個最重要的因素是再生體系的建立，只有建立了再生頻率較高的再生體系才有可能在遺傳轉化體系上有所突破，建立高效的遺傳轉化體系與對再生體系的全面系統研究密切相關。

建立高效的油菜再生體系是運用農桿菌介導法進行油菜遺傳轉化的關鍵[1]。油菜轉化效率具有極強的基因型依賴性[2]，且同一基因型不同外植體類型也有一定差異。因此，探討黑籽油菜下胚軸再生體系的主要影響因子，并由此建立農桿菌介導的下胚軸高效遺傳轉化體系，對于廣泛開展黑籽油菜的遺傳轉化具有重要意義。但遺傳轉化體系步驟很多，如預培養、共培養、篩選分化培養、生根培養等，要建立一個轉化頻率高的遺傳轉化體系需要做很多的工作，并優化改良每個步驟。筆者以甘藍型黑籽油菜為試驗材料，以下胚軸為起始外植體，對預培養中影響下胚軸再生體系及農桿菌侵染后的分化和再生能力主要因素（激素和苗齡）進行了探討，并獲得最佳的培養條件，為建立一個高效的遺傳轉化體系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料。

甘藍型油菜黑籽品種D2，為西南大學油菜工程研究中心提供。

1.1.2 菌種和質粒。

根癌農桿菌菌種是含pCNR的LBA4404，pCNR是個含卡拉霉素基因和GUS基因的雙元載體。目的基因是從匍枝根霉中克隆獲得的Δ6脂肪酸脫氫酶基因RnD6D（序列號：AY795076）[3]。

1.1.3 培養基。

①發芽培養基：MS（大量元素+微量元素+有機物+鐵鹽+3%蔗糖） ，pH 5.8；

②預培養基：A1：MS+0.2 mg/L 6BA+1.0 mg/L 2，4D，A2：MS+4.0 mg/L 6BA+1.0 mg/L 2，4D，

A3：MS+0.1 mg/L 6BA+1.5 mg/L 2，4D，pH 5.8；

③共培養基：MS+1.0 mg/L 6BA+1.0 mg/L 2，4D + 0.2 mg/L AS，pH 5.8；

④分化培養基：MS+3.0 mg/L 6BA+0.1 mg/L 2，4D+100 mg/L Kan +400 mg/L Carb，pH 5.8。

1.2 試驗方法

1.2.1 農桿菌浸染前的培養。選取籽粒飽滿的油菜種子，75%乙醇浸泡30～60 s，無菌水沖洗2次；5%的次氯酸鈉溶液浸泡15～18 min，無菌水沖洗5～6次，將種子接種于MS 固體培養基上，置培養室中26～28 ℃、光照16 h/d下萌發。分別取3、4、5 d齡無菌苗下胚軸作為外植體接入3種預培養基中，隨機區組設計，共9個處理，每個處理接200個外植體。預培養1 d后記錄下胚軸膨大個數，預培養3、5、7 d后分別記錄愈傷并統計出愈率。出愈率（%）=（長出愈傷的外植體個數/外植體總數）×100。

1.2.2 農桿菌浸染及浸染后的培養。取出-80 ℃下保存的含有目的表達載體的農桿菌菌株，置搖床上200 r/min、28 ℃下培養過夜（16～20 h）進行預活化。取25～50 ml菌液接種于同樣培養基中相同條件下培養至對數生長期。取對數生長期菌液室溫下6 000 r/min離心搜集菌體，調OD600值為0.6～0.8，取3、4、5 d 齡的0.5～1.0 cm長的下胚軸，接入3種預培養基中預培養7 d，然后浸入農桿菌菌液感染20～30 min，其間不斷振蕩使菌液與外植體充分接觸。用滅菌濾紙迅速吸干多余的菌液，將下胚軸平放在鋪有一層滅菌濾紙的分化培養基上，黑暗中共培養2 d。共培養結束后，將外植體轉入培養基中，于搖床上輕微振蕩洗滌。取出外植體吸干多余液體，接入延遲篩選分化培養基中脫菌培養10 d后，分別記錄、統計分化培養1、10 d的綠色外植體個數、黃色外植體個數、褐色外植體個數的百分比。

1.2.3 GUS染色檢測。

將獲得的抗性愈傷組織用GUS組織化學法測定。將待測定的材料，如愈傷組織或葉片，浸入適量XGluc溶液，于37 ℃保溫過夜后，染色后用乙醇脫色直至脫掉葉綠素。在體視顯微鏡下觀察，拍照記錄。

XGluc染色液：0.2 mol/L Na3PO4緩沖液（62 ml 0.2 mol/L Na2HPO4；38 ml 0.2 mol/L NaH2PO4），pH 7.0；0.1 mol/L K3[Fe（CN）6]；0.1 mol/L K4[Fe（CN）6]·3H2O；1.0 mol/L Na2EDTA；0.1% XGluc。

1.2.4 再生植株PCR檢測。

按CTAB法[4]從再生植株和非轉基因對照植株的葉片組織中提取基因組DNA，進行PCR擴增。設計編碼基因RnD6D區域的2條特異引物，用于基因組DNA擴增1.4 Kb的基因片段。RnD（6）D基因擴增的正向引物序列5ATGAGTACATTAGATCGTCAATCTAT3有26個堿基的寡核苷酸，反向引物序列5GAAAGATTTTATTTTATGCTTTCTAAAAGG 3有30個堿基的寡核苷酸。PCR的總體積是25 μl，包含有10 ng的模板DNA，2.5 μl 10× PCR緩沖液，1.5 μl 25 mmol/L MgCl2，0.5 μl 10 mmol/L dNTPs混合液，5 μmol/L正反引物各1 μl，0.25 μl Taq酶以及無菌水。PCR反應30個循環，94 ℃預變性2 min，循環包括94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min。0.8%瓊脂糖膠電泳擴增DNA片段，紫外透射儀顯像，數碼相機拍照[3]。

2 結果與分析

2.1 激素、苗齡對下胚軸再生的影響 由表1可知，A2培養基在預培養7 d過程中，對不同苗齡下胚軸的影響前5 d的效果最好，而A1培養基對5 d苗齡下胚軸的出愈率效果最好，A3培養基在7 d的效果都不是很好。從培養基中6BA、2，4D的含量分析，2，4D的適宜濃度為1.0 mg/L。高于1.0 mg/L出愈率不好。在預培養初期6BA對出愈率的影響起主導作用，其濃度越高效果越好。但在預培養后期，2，4D起主要作用，高濃度的6BA對出愈率反而起抑制作用，這也是A3培養基在這7 d的效果都不是很好的原因。從苗齡的結果可以看出，3 d苗齡下胚軸的出愈率在預培養1、5、7 d時都表現出最好的效果，而4 d苗齡下胚軸的出愈率在預培養3 d時效果最好，5 d苗齡下胚軸的出愈率在預培養7 d表現效果都不好。3 d苗齡的下胚軸組織幼嫩，去分化能力強，因此表現出高的再生率，最高可達98.85%。5 d苗齡的下胚軸纖維化程度較深，去分化能力差，因此表現出低的再生率。4 d苗齡的下胚軸介于兩者之間，在有限制條件（預培養3 d時）的情況下表現出高的再生率，最高可達83.42%。

方差分析表明，預培養1 d時，不同苗齡處理間對膨大的個數影響呈極顯著差異；不同預培養基處理間對膨大的個數影響差異不顯著。預培養3 d時，不同苗齡處理間對下胚軸的出愈率影響差異不顯著。預培養5 d時，不同苗齡處理間對出愈率影響的差異呈顯著水平。預培養7 d時，不同預培養基間和不同苗齡處理間對出愈率的影響效果均不顯著。說明不同預培養基對不同苗齡外植體的影響隨時間的延長差異并不明顯，差異顯著的主要在預培養5 d時，這與前人的研究結果一致。石淑穩等[5]研究表明，甘藍型油菜4 d苗齡的子葉于培養基上預培養2或6 d后，再轉到分化培養基上培養，不定芽再生率可提高34%～46%。王艷等[6]研究發現，帶柄子葉預培養3 d可提高植株再生頻率。

2.2 激素、苗齡對遺傳轉化的影響

共培養結束后1 d，分化培養10 d時分別統計綠色、黃色、褐色下胚軸的個數，并分別計算綠色、黃色、褐色下胚軸個數的百分比，并對這些數據進行方差分析，結果顯示，預培養基間和苗齡間的差異都不顯著。因此，分別計算每種預培養基在3、4、5 d苗齡時綠色、黃色、褐色下胚軸個數百分數的平均值；每個苗齡在A1、A2、A3培養基上預培養時綠色、黃色、褐色下胚軸個數百分數的平均值。并通過共培養1 d，分化培養10 d時綠色、黃色、褐色下胚軸個數百分數對比來分析預培養基、苗齡對遺傳轉化的影響。

綠色下胚軸表示下胚軸在農桿菌浸染后已經度過了危險期，能正常生長，發芽成苗的幾率較大。褐色下胚軸表示下胚軸在農桿菌浸染后受到傷害，接近死亡。而黃色下胚軸表示其在農桿菌的脅迫下生長，處在最敏感最危險的時期，度過這一時期就會變成綠色，正常生長，分化成苗；而挺不過去就變為褐色，慢慢死亡（圖1）。因此，分別對綠色、褐色、黃色下胚軸個數的百分比進行分析具有重要意義。

由圖2可知，培養基影響下的綠色下胚軸所占比率的平均數均呈下降趨勢；其中A2培養基下降的比率最小，A1培養基下降的比率最大，A3培養基介于兩者之間，表明A2培養基生成綠色愈傷的效果最好。

由圖3可知，苗齡影響下的綠色下胚軸所占比率的平均數均呈下降趨勢。其中4 d苗齡的下胚軸作為外植體時下降

注：A.綠色下胚軸；B.黃色下胚軸；C.褐色下胚軸。

圖1 農桿菌侵染后培養10 d的下胚軸

圖2 培養基對綠色下胚軸的影響

的比率最小，5 d苗齡的下胚軸作為外植體時下降的比率最大，3 d苗齡介于兩者之間。表明4 d苗齡的下胚軸作為外植體時，生成綠色愈傷的效果最好。

圖3 苗齡對綠色下胚軸的影響

由圖4可知，培養基影響下的黃色下胚軸所占比率的平均數A2培養基呈下降趨勢；A1和A3培養基呈上升趨勢；其中A3培養基的上升趨勢表現更為明顯，表明A2培養基受農桿菌脅迫最小。

圖4 培養基對黃色下胚軸的影響

由圖5可知，苗齡影響下的黃色下胚軸所占比率的平均數3、4 d苗齡的下胚軸作為外植體時均呈下降趨勢；5 d苗齡的下胚軸作為外植體時呈上升趨勢，表明3、4 d苗齡的下胚軸變成黃色的趨勢在下降，其中4 d苗齡下降明顯。

圖5 苗齡對黃色下胚軸的影響

由圖6可知，培養基影響下的褐色下胚軸所占比率的平均數均呈上升趨勢；A1培養基上升趨勢最為明顯；A2培養基的上升趨勢最小，表明A2培養基抵御褐化的能力最強。

圖6 培養基對褐色下胚軸的影響

由圖7可知，苗齡影響下的褐色下胚軸所占比率的平均數均呈上升趨勢；其中4 d苗齡的下胚軸作為外植體時上升趨勢不明顯，表明4 d苗齡的下胚軸抵御褐化的能力最強。

圖7 苗齡對褐色下胚軸的影響

綜合農桿菌浸染前后對下胚軸膨大、生長愈傷、顏色變化情況，A2培養基無論是對出愈率的影響，還是在抵制農桿菌浸染的效果方面都表現最好。說明愈傷組織的生長與農桿菌浸染之間存在密切的聯系。高的出愈率能更好地抵制農桿菌的浸染。3 d苗齡的下胚軸雖然出愈率高，但在農桿菌浸染后生長沒有4 d苗齡的下胚軸好。這主要是因為3 d苗齡的下胚軸組織幼嫩，在農桿菌浸染時易受到傷害，褐化死亡；也說明過多的愈傷組織并不利于浸染。而4 d苗齡的下胚軸組織既不太幼嫩，纖維化程度也不強，再生能力高，抵御農桿菌脅迫的能力強，因此，4 d苗齡的下胚軸作為遺傳轉化中預培養的外植體最好。一般認為，愈傷組織的質地對幼苗分化具有重要意義[7]，因而獲得的愈傷組織是否是抗性愈傷組織也決定了是否獲得轉基因植株。經GUS染色證實獲得的愈傷組織得到瞬時表達（圖8）。其再生的植株經PCR檢測發現（圖9）表現陽性，初步說明目的基因整合到油菜植株基因組中[8]，這樣獲得的植株是轉基因植株。

圖8 抗性愈傷組織GUS基因表達

注：1： DNA標記；2：質粒的 PCR 產物 （陽性對照）；5， 7，12，13： 非轉化植株的PCR 產物 （陰性對照）；3，4，6，8～11： Kan抗性植株的PCR 產物。

圖9 再生植株中RnD6D基因的PCR檢測

3 討論

3.1 激素對再生（出愈率）與遺傳轉化的影響

以下胚軸為外植體進行遺傳轉化，操作過程簡單，下胚軸再生能力強，遺傳轉化率高，是遺傳轉化的理想材料。一般認為下胚軸愈傷組織誘導必須在培養基中添加2，4D和6BA，因2，4D能提高內源ABA的水平，能提高愈傷分化率、質量和時間。甘藍型油菜下胚軸在被農桿菌感染期間用低濃度的2，4D培養基進行短時間預培養，能提高轉化率[9]。陸萬香等[10]研究表明，適當濃度的2，4D（0.8～1.0 mg/L）對下胚軸進行3 d左右的啟動分化，可明顯提高抗性芽率（6.3%）；2，4D濃度高于1.2 mg/L或預培養時間超過4 d外植體都會稀軟、黃化，耐感染能力顯著降低；2，4D濃度低于0.8 mg/L或預培養時間少于2 d時下胚軸分化不明顯，感染后迅速褐化、死亡。趙云等[11]比較2，4D、IAA、ZT、6BA的濃度對不同基因型甘藍型油菜下胚軸愈傷組織分化的影響，結果表明，以2，4D濃度1 mg/L和6BA濃度2 mg/L的MS培養基最優，84%以上外植體長出愈傷組織，其中34%長出芽點。該研究結果也得出了類似的結論，即2，4D濃度為1.0 mg/L時，下胚軸的再生能力和分化能力最強。2，4D是植物組織培養中最常見的愈傷組織誘導劑，能有效地誘導植物細胞的脫分化，其濃度對愈傷組織的數量和質量均有較大影響。2，4D屬于生長素類物質，低濃度對生長起促進作用，高濃度則起抑制作用，1 mg/L對誘導油菜下胚軸的愈傷為最適宜濃度。同時，研究發現6BA濃度4 mg/L時，效果較好，與前人的研究結果有一定差異，這可能與試驗設計有關。試驗設計時共培養時間沒有作梯度設計，而是直接培養2 d后進行分化培養，因而2，4D培養時間、濃度差異不大，6BA成為愈傷組織變化的主要因素。綜上所述，外植體的再生頻率與遺傳轉化的效果之間具有密切聯系。激素影響再生頻率，也間接和直接影響遺傳轉化。

3.2 苗齡對再生（出愈率）與遺傳轉化的影響

苗齡是影響外植體生理狀態的重要因素。許本波等[12]研究認為，苗齡越大，下胚軸會變得細弱，不利于芽的分化；苗齡越小，下胚軸過嫩，切割外植體時易損傷表皮導致失水嚴重，下胚軸易死亡，再生培養出芽率很低；因而苗齡恰當，下胚軸粗壯，有利于獲得較高的出芽率。該研究結果表明，3 d苗齡下胚軸的再生能力很強，出愈率最高，這和王艷等[13]研究結果一致。石淑穩等[14]研究也表明，外植體采用預培養，苗齡在7 d以上是不適宜的。但4 d苗齡下胚軸的出愈率僅次于3 d苗齡下胚軸的出愈率，其下胚軸農桿菌浸染后遺傳轉化效果最好。這與前人結論不同，說明過多的愈傷組織并不利于浸染。3 d苗齡下胚軸的愈傷生長速度最快，但長出的愈傷抵御農桿菌傷害的能力差，農桿菌浸染后易褐化死亡。而4 d苗齡下胚軸的愈傷生長速度達到對數增長的旺盛時期，其抵御農桿菌傷害的能力強，農桿菌浸染后能很快適應不利的外界環境條件正常生長。該研究結果也表明其長出的愈傷更利于成為抗性愈傷（圖8）。