甘藍(lán)型黑籽油菜遺傳轉(zhuǎn)化中預(yù)培養(yǎng)環(huán)節(jié)的優(yōu)化

林吶　劉梅　丁凌

摘要 [目的]對甘藍(lán)型黑籽油菜遺傳轉(zhuǎn)化中預(yù)培養(yǎng)環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化。[方法]利用甘藍(lán)型黑籽油菜下胚軸為外植體，對油菜下胚軸的預(yù)培養(yǎng)及其浸染后影響再生和分化情況進(jìn)行研究，分別從苗齡、激素兩方面討論了下胚軸再生與分化頻率的影響。[結(jié)果]苗齡、激素與遺傳轉(zhuǎn)化之間存在密切的聯(lián)系。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜下胚軸預(yù)培養(yǎng)最佳體系是：4 d苗齡的外植體在農(nóng)桿菌侵染前進(jìn)行5 d預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)基是MS+2，4D 1.0 mg/L+ 6BA 4.0 mg/L。綠色抗性愈傷組織獲得GUS瞬時(shí)表達(dá)，PCR鑒定再生植株為轉(zhuǎn)基因植株。[結(jié)論] 該研究獲得了最佳的預(yù)培養(yǎng)條件，為建立一個(gè)高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 甘藍(lán)型油菜；遺傳轉(zhuǎn)化；預(yù)培養(yǎng)

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）20-06556-04

近幾十年來，隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的飛速發(fā)展，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在培育油菜新品種中應(yīng)用越來越廣泛。而影響遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的一個(gè)最重要的因素是再生體系的建立，只有建立了再生頻率較高的再生體系才有可能在遺傳轉(zhuǎn)化體系上有所突破，建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系與對再生體系的全面系統(tǒng)研究密切相關(guān)。

建立高效的油菜再生體系是運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行油菜遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵[1]。油菜轉(zhuǎn)化效率具有極強(qiáng)的基因型依賴性[2]，且同一基因型不同外植體類型也有一定差異。因此，探討黑籽油菜下胚軸再生體系的主要影響因子，并由此建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，對于廣泛開展黑籽油菜的遺傳轉(zhuǎn)化具有重要意義。但遺傳轉(zhuǎn)化體系步驟很多，如預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、篩選分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等，要建立一個(gè)轉(zhuǎn)化頻率高的遺傳轉(zhuǎn)化體系需要做很多的工作，并優(yōu)化改良每個(gè)步驟。筆者以甘藍(lán)型黑籽油菜為試驗(yàn)材料，以下胚軸為起始外植體，對預(yù)培養(yǎng)中影響下胚軸再生體系及農(nóng)桿菌侵染后的分化和再生能力主要因素（激素和苗齡）進(jìn)行了探討，并獲得最佳的培養(yǎng)條件，為建立一個(gè)高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料。

甘藍(lán)型油菜黑籽品種D2，為西南大學(xué)油菜工程研究中心提供。

1.1.2 菌種和質(zhì)粒。

根癌農(nóng)桿菌菌種是含pCNR的LBA4404，pCNR是個(gè)含卡拉霉素基因和GUS基因的雙元載體。目的基因是從匍枝根霉中克隆獲得的Δ6脂肪酸脫氫酶基因RnD6D（序列號(hào)：AY795076）[3]。

1.1.3 培養(yǎng)基。

①發(fā)芽培養(yǎng)基：MS（大量元素+微量元素+有機(jī)物+鐵鹽+3%蔗糖） ，pH 5.8；

②預(yù)培養(yǎng)基：A1：MS+0.2 mg/L 6BA+1.0 mg/L 2，4D，A2：MS+4.0 mg/L 6BA+1.0 mg/L 2，4D，

A3：MS+0.1 mg/L 6BA+1.5 mg/L 2，4D，pH 5.8；

③共培養(yǎng)基：MS+1.0 mg/L 6BA+1.0 mg/L 2，4D + 0.2 mg/L AS，pH 5.8；

④分化培養(yǎng)基：MS+3.0 mg/L 6BA+0.1 mg/L 2，4D+100 mg/L Kan +400 mg/L Carb，pH 5.8。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)桿菌浸染前的培養(yǎng)。選取籽粒飽滿的油菜種子，75%乙醇浸泡30～60 s，無菌水沖洗2次；5%的次氯酸鈉溶液浸泡15～18 min，無菌水沖洗5～6次，將種子接種于MS 固體培養(yǎng)基上，置培養(yǎng)室中26～28 ℃、光照16 h/d下萌發(fā)。分別取3、4、5 d齡無菌苗下胚軸作為外植體接入3種預(yù)培養(yǎng)基中，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共9個(gè)處理，每個(gè)處理接200個(gè)外植體。預(yù)培養(yǎng)1 d后記錄下胚軸膨大個(gè)數(shù)，預(yù)培養(yǎng)3、5、7 d后分別記錄愈傷并統(tǒng)計(jì)出愈率。出愈率（%）=（長出愈傷的外植體個(gè)數(shù)/外植體總數(shù)）×100。

1.2.2 農(nóng)桿菌浸染及浸染后的培養(yǎng)。取出-80 ℃下保存的含有目的表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株，置搖床上200 r/min、28 ℃下培養(yǎng)過夜（16～20 h）進(jìn)行預(yù)活化。取25～50 ml菌液接種于同樣培養(yǎng)基中相同條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期。取對數(shù)生長期菌液室溫下6 000 r/min離心搜集菌體，調(diào)OD600值為0.6～0.8，取3、4、5 d 齡的0.5～1.0 cm長的下胚軸，接入3種預(yù)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)7 d，然后浸入農(nóng)桿菌菌液感染20～30 min，其間不斷振蕩使菌液與外植體充分接觸。用滅菌濾紙迅速吸干多余的菌液，將下胚軸平放在鋪有一層滅菌濾紙的分化培養(yǎng)基上，黑暗中共培養(yǎng)2 d。共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中，于搖床上輕微振蕩洗滌。取出外植體吸干多余液體，接入延遲篩選分化培養(yǎng)基中脫菌培養(yǎng)10 d后，分別記錄、統(tǒng)計(jì)分化培養(yǎng)1、10 d的綠色外植體個(gè)數(shù)、黃色外植體個(gè)數(shù)、褐色外植體個(gè)數(shù)的百分比。

1.2.3 GUS染色檢測。

將獲得的抗性愈傷組織用GUS組織化學(xué)法測定。將待測定的材料，如愈傷組織或葉片，浸入適量XGluc溶液，于37 ℃保溫過夜后，染色后用乙醇脫色直至脫掉葉綠素。在體視顯微鏡下觀察，拍照記錄。

XGluc染色液：0.2 mol/L Na3PO4緩沖液（62 ml 0.2 mol/L Na2HPO4；38 ml 0.2 mol/L NaH2PO4），pH 7.0；0.1 mol/L K3[Fe（CN）6]；0.1 mol/L K4[Fe（CN）6]·3H2O；1.0 mol/L Na2EDTA；0.1% XGluc。

1.2.4 再生植株P(guān)CR檢測。

按CTAB法[4]從再生植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑娜~片組織中提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)編碼基因RnD6D區(qū)域的2條特異引物，用于基因組DNA擴(kuò)增1.4 Kb的基因片段。RnD（6）D基因擴(kuò)增的正向引物序列5ATGAGTACATTAGATCGTCAATCTAT3有26個(gè)堿基的寡核苷酸，反向引物序列5GAAAGATTTTATTTTATGCTTTCTAAAAGG 3有30個(gè)堿基的寡核苷酸。PCR的總體積是25 μl，包含有10 ng的模板DNA，2.5 μl 10× PCR緩沖液，1.5 μl 25 mmol/L MgCl2，0.5 μl 10 mmol/L dNTPs混合液，5 μmol/L正反引物各1 μl，0.25 μl Taq酶以及無菌水。PCR反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，94 ℃預(yù)變性2 min，循環(huán)包括94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min。0.8%瓊脂糖膠電泳擴(kuò)增DNA片段，紫外透射儀顯像，數(shù)碼相機(jī)拍照[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素、苗齡對下胚軸再生的影響 由表1可知，A2培養(yǎng)基在預(yù)培養(yǎng)7 d過程中，對不同苗齡下胚軸的影響前5 d的效果最好，而A1培養(yǎng)基對5 d苗齡下胚軸的出愈率效果最好，A3培養(yǎng)基在7 d的效果都不是很好。從培養(yǎng)基中6BA、2，4D的含量分析，2，4D的適宜濃度為1.0 mg/L。高于1.0 mg/L出愈率不好。在預(yù)培養(yǎng)初期6BA對出愈率的影響起主導(dǎo)作用，其濃度越高效果越好。但在預(yù)培養(yǎng)后期，2，4D起主要作用，高濃度的6BA對出愈率反而起抑制作用，這也是A3培養(yǎng)基在這7 d的效果都不是很好的原因。從苗齡的結(jié)果可以看出，3 d苗齡下胚軸的出愈率在預(yù)培養(yǎng)1、5、7 d時(shí)都表現(xiàn)出最好的效果，而4 d苗齡下胚軸的出愈率在預(yù)培養(yǎng)3 d時(shí)效果最好，5 d苗齡下胚軸的出愈率在預(yù)培養(yǎng)7 d表現(xiàn)效果都不好。3 d苗齡的下胚軸組織幼嫩，去分化能力強(qiáng)，因此表現(xiàn)出高的再生率，最高可達(dá)98.85%。5 d苗齡的下胚軸纖維化程度較深，去分化能力差，因此表現(xiàn)出低的再生率。4 d苗齡的下胚軸介于兩者之間，在有限制條件（預(yù)培養(yǎng)3 d時(shí)）的情況下表現(xiàn)出高的再生率，最高可達(dá)83.42%。

方差分析表明，預(yù)培養(yǎng)1 d時(shí)，不同苗齡處理間對膨大的個(gè)數(shù)影響呈極顯著差異；不同預(yù)培養(yǎng)基處理間對膨大的個(gè)數(shù)影響差異不顯著。預(yù)培養(yǎng)3 d時(shí)，不同苗齡處理間對下胚軸的出愈率影響差異不顯著。預(yù)培養(yǎng)5 d時(shí)，不同苗齡處理間對出愈率影響的差異呈顯著水平。預(yù)培養(yǎng)7 d時(shí)，不同預(yù)培養(yǎng)基間和不同苗齡處理間對出愈率的影響效果均不顯著。說明不同預(yù)培養(yǎng)基對不同苗齡外植體的影響隨時(shí)間的延長差異并不明顯，差異顯著的主要在預(yù)培養(yǎng)5 d時(shí)，這與前人的研究結(jié)果一致。石淑穩(wěn)等[5]研究表明，甘藍(lán)型油菜4 d苗齡的子葉于培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2或6 d后，再轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，不定芽再生率可提高34%～46%。王艷等[6]研究發(fā)現(xiàn)，帶柄子葉預(yù)培養(yǎng)3 d可提高植株再生頻率。

2.2 激素、苗齡對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

共培養(yǎng)結(jié)束后1 d，分化培養(yǎng)10 d時(shí)分別統(tǒng)計(jì)綠色、黃色、褐色下胚軸的個(gè)數(shù)，并分別計(jì)算綠色、黃色、褐色下胚軸個(gè)數(shù)的百分比，并對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示，預(yù)培養(yǎng)基間和苗齡間的差異都不顯著。因此，分別計(jì)算每種預(yù)培養(yǎng)基在3、4、5 d苗齡時(shí)綠色、黃色、褐色下胚軸個(gè)數(shù)百分?jǐn)?shù)的平均值；每個(gè)苗齡在A1、A2、A3培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)時(shí)綠色、黃色、褐色下胚軸個(gè)數(shù)百分?jǐn)?shù)的平均值。并通過共培養(yǎng)1 d，分化培養(yǎng)10 d時(shí)綠色、黃色、褐色下胚軸個(gè)數(shù)百分?jǐn)?shù)對比來分析預(yù)培養(yǎng)基、苗齡對遺傳轉(zhuǎn)化的影響。

綠色下胚軸表示下胚軸在農(nóng)桿菌浸染后已經(jīng)度過了危險(xiǎn)期，能正常生長，發(fā)芽成苗的幾率較大。褐色下胚軸表示下胚軸在農(nóng)桿菌浸染后受到傷害，接近死亡。而黃色下胚軸表示其在農(nóng)桿菌的脅迫下生長，處在最敏感最危險(xiǎn)的時(shí)期，度過這一時(shí)期就會(huì)變成綠色，正常生長，分化成苗；而挺不過去就變?yōu)楹稚?，慢慢死亡（圖1）。因此，分別對綠色、褐色、黃色下胚軸個(gè)數(shù)的百分比進(jìn)行分析具有重要意義。

由圖2可知，培養(yǎng)基影響下的綠色下胚軸所占比率的平均數(shù)均呈下降趨勢；其中A2培養(yǎng)基下降的比率最小，A1培養(yǎng)基下降的比率最大，A3培養(yǎng)基介于兩者之間，表明A2培養(yǎng)基生成綠色愈傷的效果最好。

由圖3可知，苗齡影響下的綠色下胚軸所占比率的平均數(shù)均呈下降趨勢。其中4 d苗齡的下胚軸作為外植體時(shí)下降

注：A.綠色下胚軸；B.黃色下胚軸；C.褐色下胚軸。

圖1 農(nóng)桿菌侵染后培養(yǎng)10 d的下胚軸

圖2 培養(yǎng)基對綠色下胚軸的影響

的比率最小，5 d苗齡的下胚軸作為外植體時(shí)下降的比率最大，3 d苗齡介于兩者之間。表明4 d苗齡的下胚軸作為外植體時(shí)，生成綠色愈傷的效果最好。

圖3 苗齡對綠色下胚軸的影響

由圖4可知，培養(yǎng)基影響下的黃色下胚軸所占比率的平均數(shù)A2培養(yǎng)基呈下降趨勢；A1和A3培養(yǎng)基呈上升趨勢；其中A3培養(yǎng)基的上升趨勢表現(xiàn)更為明顯，表明A2培養(yǎng)基受農(nóng)桿菌脅迫最小。

圖4 培養(yǎng)基對黃色下胚軸的影響

由圖5可知，苗齡影響下的黃色下胚軸所占比率的平均數(shù)3、4 d苗齡的下胚軸作為外植體時(shí)均呈下降趨勢；5 d苗齡的下胚軸作為外植體時(shí)呈上升趨勢，表明3、4 d苗齡的下胚軸變成黃色的趨勢在下降，其中4 d苗齡下降明顯。

圖5 苗齡對黃色下胚軸的影響

由圖6可知，培養(yǎng)基影響下的褐色下胚軸所占比率的平均數(shù)均呈上升趨勢；A1培養(yǎng)基上升趨勢最為明顯；A2培養(yǎng)基的上升趨勢最小，表明A2培養(yǎng)基抵御褐化的能力最強(qiáng)。

圖6 培養(yǎng)基對褐色下胚軸的影響

由圖7可知，苗齡影響下的褐色下胚軸所占比率的平均數(shù)均呈上升趨勢；其中4 d苗齡的下胚軸作為外植體時(shí)上升趨勢不明顯，表明4 d苗齡的下胚軸抵御褐化的能力最強(qiáng)。

圖7 苗齡對褐色下胚軸的影響

綜合農(nóng)桿菌浸染前后對下胚軸膨大、生長愈傷、顏色變化情況，A2培養(yǎng)基無論是對出愈率的影響，還是在抵制農(nóng)桿菌浸染的效果方面都表現(xiàn)最好。說明愈傷組織的生長與農(nóng)桿菌浸染之間存在密切的聯(lián)系。高的出愈率能更好地抵制農(nóng)桿菌的浸染。3 d苗齡的下胚軸雖然出愈率高，但在農(nóng)桿菌浸染后生長沒有4 d苗齡的下胚軸好。這主要是因?yàn)? d苗齡的下胚軸組織幼嫩，在農(nóng)桿菌浸染時(shí)易受到傷害，褐化死亡；也說明過多的愈傷組織并不利于浸染。而4 d苗齡的下胚軸組織既不太幼嫩，纖維化程度也不強(qiáng)，再生能力高，抵御農(nóng)桿菌脅迫的能力強(qiáng)，因此，4 d苗齡的下胚軸作為遺傳轉(zhuǎn)化中預(yù)培養(yǎng)的外植體最好。一般認(rèn)為，愈傷組織的質(zhì)地對幼苗分化具有重要意義[7]，因而獲得的愈傷組織是否是抗性愈傷組織也決定了是否獲得轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)GUS染色證實(shí)獲得的愈傷組織得到瞬時(shí)表達(dá)（圖8）。其再生的植株經(jīng)PCR檢測發(fā)現(xiàn)（圖9）表現(xiàn)陽性，初步說明目的基因整合到油菜植株基因組中[8]，這樣獲得的植株是轉(zhuǎn)基因植株。

圖8 抗性愈傷組織GUS基因表達(dá)

注：1： DNA標(biāo)記；2：質(zhì)粒的 PCR 產(chǎn)物 （陽性對照）；5， 7，12，13： 非轉(zhuǎn)化植株的PCR 產(chǎn)物 （陰性對照）；3，4，6，8～11： Kan抗性植株的PCR 產(chǎn)物。

圖9 再生植株中RnD6D基因的PCR檢測

3 討論

3.1 激素對再生（出愈率）與遺傳轉(zhuǎn)化的影響

以下胚軸為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，操作過程簡單，下胚軸再生能力強(qiáng)，遺傳轉(zhuǎn)化率高，是遺傳轉(zhuǎn)化的理想材料。一般認(rèn)為下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)必須在培養(yǎng)基中添加2，4D和6BA，因2，4D能提高內(nèi)源ABA的水平，能提高愈傷分化率、質(zhì)量和時(shí)間。甘藍(lán)型油菜下胚軸在被農(nóng)桿菌感染期間用低濃度的2，4D培養(yǎng)基進(jìn)行短時(shí)間預(yù)培養(yǎng)，能提高轉(zhuǎn)化率[9]。陸萬香等[10]研究表明，適當(dāng)濃度的2，4D（0.8～1.0 mg/L）對下胚軸進(jìn)行3 d左右的啟動(dòng)分化，可明顯提高抗性芽率（6.3%）；2，4D濃度高于1.2 mg/L或預(yù)培養(yǎng)時(shí)間超過4 d外植體都會(huì)稀軟、黃化，耐感染能力顯著降低；2，4D濃度低于0.8 mg/L或預(yù)培養(yǎng)時(shí)間少于2 d時(shí)下胚軸分化不明顯，感染后迅速褐化、死亡。趙云等[11]比較2，4D、IAA、ZT、6BA的濃度對不同基因型甘藍(lán)型油菜下胚軸愈傷組織分化的影響，結(jié)果表明，以2，4D濃度1 mg/L和6BA濃度2 mg/L的MS培養(yǎng)基最優(yōu)，84%以上外植體長出愈傷組織，其中34%長出芽點(diǎn)。該研究結(jié)果也得出了類似的結(jié)論，即2，4D濃度為1.0 mg/L時(shí)，下胚軸的再生能力和分化能力最強(qiáng)。2，4D是植物組織培養(yǎng)中最常見的愈傷組織誘導(dǎo)劑，能有效地誘導(dǎo)植物細(xì)胞的脫分化，其濃度對愈傷組織的數(shù)量和質(zhì)量均有較大影響。2，4D屬于生長素類物質(zhì)，低濃度對生長起促進(jìn)作用，高濃度則起抑制作用，1 mg/L對誘導(dǎo)油菜下胚軸的愈傷為最適宜濃度。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)6BA濃度4 mg/L時(shí)，效果較好，與前人的研究結(jié)果有一定差異，這可能與試驗(yàn)設(shè)計(jì)有關(guān)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)共培養(yǎng)時(shí)間沒有作梯度設(shè)計(jì)，而是直接培養(yǎng)2 d后進(jìn)行分化培養(yǎng)，因而2，4D培養(yǎng)時(shí)間、濃度差異不大，6BA成為愈傷組織變化的主要因素。綜上所述，外植體的再生頻率與遺傳轉(zhuǎn)化的效果之間具有密切聯(lián)系。激素影響再生頻率，也間接和直接影響遺傳轉(zhuǎn)化。

3.2 苗齡對再生（出愈率）與遺傳轉(zhuǎn)化的影響

苗齡是影響外植體生理狀態(tài)的重要因素。許本波等[12]研究認(rèn)為，苗齡越大，下胚軸會(huì)變得細(xì)弱，不利于芽的分化；苗齡越小，下胚軸過嫩，切割外植體時(shí)易損傷表皮導(dǎo)致失水嚴(yán)重，下胚軸易死亡，再生培養(yǎng)出芽率很低；因而苗齡恰當(dāng)，下胚軸粗壯，有利于獲得較高的出芽率。該研究結(jié)果表明，3 d苗齡下胚軸的再生能力很強(qiáng)，出愈率最高，這和王艷等[13]研究結(jié)果一致。石淑穩(wěn)等[14]研究也表明，外植體采用預(yù)培養(yǎng)，苗齡在7 d以上是不適宜的。但4 d苗齡下胚軸的出愈率僅次于3 d苗齡下胚軸的出愈率，其下胚軸農(nóng)桿菌浸染后遺傳轉(zhuǎn)化效果最好。這與前人結(jié)論不同，說明過多的愈傷組織并不利于浸染。3 d苗齡下胚軸的愈傷生長速度最快，但長出的愈傷抵御農(nóng)桿菌傷害的能力差，農(nóng)桿菌浸染后易褐化死亡。而4 d苗齡下胚軸的愈傷生長速度達(dá)到對數(shù)增長的旺盛時(shí)期，其抵御農(nóng)桿菌傷害的能力強(qiáng)，農(nóng)桿菌浸染后能很快適應(yīng)不利的外界環(huán)境條件正常生長。該研究結(jié)果也表明其長出的愈傷更利于成為抗性愈傷（圖8）。