魔芋灰霉病病原菌的分子鑒定

劉小芳等

摘要 [目的]對魔芋灰霉病病原菌進行分子鑒定。[方法]通過提取DNA、 PCR擴增、電泳檢測以及魔芋灰霉病病原菌rDNA的ITS序列分析。[結果] 采用CTAB法得到的DNA產量較高且純度較好；以其為模板進行PCR擴增，條帶清晰；ITS序列測序證實魔芋灰霉病病原菌屬于富氏葡萄孢盤菌（Botryotinica fuckeliana），Genbank 登陸號KF802809。[結論] 該致病菌在魔芋種芋儲藏期間和設施繁育過程中危害極為嚴重，屬首次報道，為魔芋灰霉病的防治提供理論依據。

關鍵詞 灰霉病；PCR擴增；ITS

中圖分類號 S181.3 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）20-06560-02

灰霉病是露地、保護地作物常見且較難防治的一種真菌性病害[1]，它能侵害多種不同的植物，包括蔬菜、中草藥、作物、草坪、果樹等[2-3]。近年來，隨著魔芋人工種植面積的不斷擴大及種植年限的增加，魔芋灰霉病的發生及危害性逐年加重，嚴重影響了魔芋種植業的發展和魔芋的產業化[3]。然而，大多對灰霉病病原菌的鑒定僅局限在傳統的菌物分類系統上，而傳統的菌物分類是以其形態特征和生理生化指標為分類基礎，大部分菌物的種類多且分布廣，形態特征也較復雜，且少數形態特征和生理生化指標隨著環境的變化而不穩定[3-5]。近年來，人們利用病原菌核糖體ITS基因區段的擴增對病原菌進行鑒定檢測及診斷病害的技術得到了較快的發展，相比傳統的菌物分類方法，顯示出較大的優越性。鑒于此，筆者通過對魔芋灰霉病病原菌rDNA的ITS序列分析，從基因水平上確定了引起魔芋灰霉病的病原菌，為今后魔芋的抗病育種和病害防治提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株 所用菌株為從染灰霉病的魔芋植株上分離、純化而來，并經致病性鑒定后保存。

1.2 魔芋灰霉病病原菌的DNA提取及檢測

參照改良CTAB法[5-6] 提取魔芋灰霉病病原菌DNA，總DNA純度及濃度的檢測用紫外分光光度計（DU700，Beckman Co.，USA）[7]檢測：取DNA溶液稀釋一定倍數，于分光光度計下測定A260和A260/A280值；電泳檢測：1%瓊脂糖120 V電泳50 min，EB染色后，于凝膠成像系統下（Gel Doc X R，BioRad Co.，USA）[7]拍照。

1.3 PCR擴增及序列測定

1.3.1 引物?；颐共〔≡膔DNA的ITS區域PCR擴增選用的通用引物為ITS4和ITS5，其堿基序列：ITS4（5TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC3），ITS5（5GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G3）。

1.3.2 PCR擴增。25 μl反應體系：10×Buffer（含MgCl2）2.5 μl；2.5 mmol/L dNTP 1 μl；10 mmol/L 引物各0.5 μl；2.5 U/ulTaq酶0.2 μl；ddH2O 19.3 μl，模板2 μl。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物回收、轉化、鏈接和測序，將測序結果提交Genbank進行比對分析。根據序列分析的結果，對所分離的病原菌進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 魔芋灰霉病病原菌DNA的質量檢測

改良的CTAB法提取的DNA產率較好，超過500 mg/g；A260為0.392，A260/A280為1.90，介于理論范圍1.8～2.0，表明該方法提取的DNA產量高且質量好。

2.2 魔芋灰霉病病原菌ITS片段PCR擴增

以提取的待測菌株總DNA為模板，以ITS4和ITS5為引物進行PCR擴增，待檢真菌菌株的DNAITS PCR產物經凝膠電泳能擴增出目的條帶，擴增產物大小在 500～600 bp（圖1）。

注：M：Marker；1～10：待測菌株DNA。

圖1 魔芋灰霉病病原菌PCR擴增結果

2.3 魔芋灰霉病病原菌ITS序列分析

用通用引物對魔芋灰霉病病原菌rDNA ITS進行擴增，能擴增出約560 bp的特異性片段，對擴增產物進行測序后獲得序列（圖2），此序列提交Genbank數據庫進行對比分析，與Botryotinica fuckeliana（富氏葡萄孢盤菌）相似性達99%及其以上。因此，可確認魔芋灰霉病病原菌屬于富氏葡萄孢盤菌（Botryotinica fuckeliana），屬首次報道。

圖2 魔芋灰霉病病原菌（Botryotinica fuckeliana）rDNA 的ITS序列

3 討論

真菌在生長過程中其形態特征受環境的影響或存在有中間種的情況，這在應用形態學鑒定時很不準確，而利用現代分子生物學技術鑒定能直接反映基因本身，具有傳統形態學鑒定法無法比擬的優越性。因此，該研究利用ITS序列測序分析，結果穩定可靠，方便快捷，為魔芋灰霉病的防治提供理論依據。

應用PCR技術對魔芋灰霉病進行檢測具有巨大的潛力，但該技術對所用引物的設計和合成要求較高。該研究中利用通用引物ITS4和ITS5對病原菌進行PCR擴增，將PCR產物測序后提交到Genbank上比對分析，確定其分類地位。此方法的最大優點是適于對所有真菌的鑒定研究，而不足之處在于必須測序比對后才能明確該病原菌的分類地位[8]。該研究已完成魔芋灰霉病病原菌的序列分析，為魔芋灰霉病的防治提供了理論依據。因此，下一步工作將進行魔芋灰霉病病原菌的藥物篩選，防止灰霉病在魔芋種芋儲藏期間和設施繁育過程中發生。

參考文獻

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