利用SSR分子標記快速鑒別中粒種與小粒種咖啡

王曉陽等

摘 要 為快速、準確地鑒別中粒種與小粒種咖啡，以不同種源的中粒種和小粒種咖啡為試驗材料，對514對SSR引物進行中、小粒種咖啡種間特異性引物篩選，最終篩選到1對特異性引物，該引物在小粒種咖啡樣本中擴增出90 bp和110 bp雙帶產物，而在中粒種咖啡樣本中只擴增出90 bp或100 bp的單帶產物，根據產物條帶的數目即可對中粒種和小粒種咖啡進行鑒別。經隨機抽取中、小粒種咖啡樣本進行種類鑒別準確性驗證，驗證結果與實際結果一致。

關鍵詞 中粒種咖啡；小粒種咖啡；SSR；鑒別

中圖分類號 S571.2 文獻標識碼 A

Distinguishing Analysis Between Coffea canephora and

C. arabica Species by SSR Markers

WANG Xiaoyang1， DONG Yunping1 *， HUANG Lifang1， YAN Lin1

ZHOU Hua2， CHEN Jinhuan3， SUN Yan1， LIN Xingjun1

1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS / Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops，

Ministry of Agriculture / Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice

and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China

2 Dehong Tropical Agriculture Institute of Yunnan， Ruili， Yunnan 678600， China

3 Tropical and Subtropical Economic Crops Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Baoshan，

Yunnan 678025， China

Abstract This study was conducted to provide an efficient method to distinguish between C. canephora and C. arabica. One pair of coffee species-specific SSR primers were selected from 514 pairs of SSR primers. The results of PCR amplifying analysis demonstrated that two fragments of 90 and 110 bp from C. arabica and one fragment of 90 or 100 bp from C. canephora were respectively amplified by the primers， meaning C. arabica and C. Canephora coffee could be identified according to the number of amplified fragments. The result of the method was proved to be reliable through our verification test.

Key words Coffea canephora； Coffea arabica； SSR； Distinguishing

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.002

咖啡為世界三大飲料之首，是國際貿易中非常重要的原料產品[1-2]。咖啡為茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）植物，該屬植物共100多種，而生產性栽培的主要為小粒種和中粒種，小粒種約占栽培面積的70%，中粒種約占30%[3-5]。小粒種咖啡因其品質優于中粒種咖啡，其國際市場交易價格也經常是中粒種咖啡的2～3倍，因此，在咖啡貿易過程中常常出現將中粒種咖啡冒充小粒種咖啡進行銷售的不法行為，損害消費者的利益[6]；另外，兩種咖啡適合種植的生長環境也有差異，小粒種適合種植于高海拔溫熱地帶，而中粒種適合種植于低海拔的高溫濕熱地區，如果兩種咖啡的種子或苗木發生混淆，則會造成咖啡減產并影響咖啡品質，給咖啡種植者帶來很大影響[7-8]。因此，生產和市場貿易上急需一種快速、方便、可靠的鑒別中、小粒種咖啡的檢測方法。

傳統方法鑒別中、小粒種咖啡主要通過將咖啡培炒后進行杯品品嘗，這種方法容易受主觀人為因素及培炒條件等影響，鑒別結果不準確，且需要專業杯品師參與，可操作性差。現有中、小粒種咖啡鑒別技術主要包括化學分析法及DNA分子標記檢測法。化學分析法主要基于兩種咖啡內含特定化學物質含量存在差異，通過測定這些化學物質含量，如固醇類、脂肪酸、綠原酸及咖啡因等，再與標準樣品進行比較鑒別，由于這類化學物質含量都處于一個幅度范圍，沒有固定值，且含量差異不是十分明顯，同時，某些化學物質含量容易受栽培條件、代謝生理等因素的影響，檢測結果精確性較差[9-11]。

基于檢測DNA分子水平多態性的分子標記技術的發展為種間鑒別提供了有效途徑，DNA分子標記可以直接反映DNA水平上的遺傳多態性，表現為核苷酸序列上的差異，這種方法不受人為及環境因素的影響，檢測結果非常精確。在所有分子標記中，SSR分子標記由于具有染色體上分布均勻、多態性豐富、共顯性、分辨率高和易于檢測等優點，自開發以來就成為最為有效構建許多作物指紋圖譜的工具，被廣泛應用于品種鑒定等方面[12-14]。目前尚未有利用SSR 分子標記鑒別咖啡種類的方法，因此，本研究擬開發出一種利用SSR分子標記快速鑒別中粒種與小粒種咖啡的方法，為咖啡生產上種子、苗木種類鑒定及咖啡市場貿易中產品的真偽鑒別提供有效的工具。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為中粒種和小粒種咖啡不同種質葉片，分別取自中國熱帶農業科學院香料飲料研究所（以下簡稱“香飲所”）、云南省德宏熱帶農業科學研究所（以下簡稱“德熱所”）和云南省農業科學院熱帶亞熱帶經濟作物研究所（以下簡稱“熱經所”）咖啡種質資源圃。材料分兩部分，一部分用于篩選中粒種、小粒種咖啡種間特異性SSR引物（表1），另一部分用于驗證所篩選引物在中粒種與小粒種之間的種間特異性。取上述種質樣本的新鮮無病斑嫩葉，置于-70 ℃超低溫冰箱保存備用或利用硅膠干燥劑干樣保存。

1.2 方法

2 結果與分析

2.1 引物初篩

特異性引物篩選所用引物來源于文獻及數據庫已發表、公布的咖啡種屬特異性SSR引物[15-24]，共514對。利用中、小粒種咖啡樣本各2個（中粒種：越南、泰國；小粒種：卡蒂姆7963、鐵畢卡）進行篩選，剔除無擴增產物或無多態性引物，選留擴增條帶清晰、重復性好、種內一致性較高、種間差別明顯的引物作為候選引物，初步篩選出種間特異性候選引物10對（圖1）。

2.2 引物復篩

利用中、小粒種咖啡樣本各20個，對初步篩選出的10對SSR引物進行復篩，最終篩選出中、小粒種咖啡種間特異性SSR引物1對，引物名稱為：SSR124195，引物序列為：Forward primer（5′-3′）：ATCCCCATCAGAAGACCTCA；Reverse primer（5′-3′）：CCTCCACCGCCTGTTTATTA。該引物在小粒種咖啡樣本中擴增出90 bp和110 bp雙帶產物，而在中粒種咖啡樣本中只擴增出90 bp或100 bp的單帶產物（圖2），因此，根據產物條帶的數目即可對中粒種和小粒種咖啡進行鑒別，即雙帶為小粒種咖啡，單帶為中粒種咖啡。中、小粒種咖啡樣本及SSR124195對樣本的擴增情況見表2。

2.3 種屬鑒別驗證

田間隨機抽取中、小粒種咖啡樣本各23份，利用SSR124195引物進行種屬鑒別，結果顯示，中粒種樣本擴增條帶全部為90 bp或100 bp的單帶產物（圖3），小粒種全部為90 bp和110 bp的雙帶產物（圖4），驗證結果與實際結果一致。

3 討論與結論

分子標記技術因直接檢測DNA分子水平上的遺傳差異，不受人為及環境因素的影響，相比其他鑒別中、小粒種咖啡的方法，分子標記在檢測精度上具有非常明顯的優勢。Spaniolas[25]等利用PCR-RFLP技術對中、小粒種咖啡進行了鑒別研究。該方法基于咖啡trnL-trnF基因中長度為251 bp的一段序列，該序列包含一限制性酶切位點，能夠被限制性酶Psul酶切成92和159 bp兩個片段。小粒種在該酶切位點上存在1個SNP，因而不能被酶切，電泳檢測結果為251 bp一條條帶，而中粒種不存在該SNP，電泳檢測結果為92和195 bp兩條條帶，因此，根據酶切后電泳檢測結果能夠很好地區分中、小粒種咖啡，然而，該方法因檢測過程中需要使用限制性酶酶切，操作過程復雜且成本較高，在使用上受到較大限制。與前人的方法相比，本研究操作簡便、快速，且重復性好、鑒定結果準確可靠，具有較好的應用前景。

本研究篩選出的SSR124195引物為中粒種、小粒種咖啡的鑒別提供了一種有效途徑，如何保證鑒別效果的準確性和穩定性是本研究最為關心的問題，這就要求引物篩選所采用的樣本必須具有足夠的信息量和代表性。本研究采用的中、小粒種咖啡樣本均取自中國熱帶農業科學院香料飲料研究所、云南省德宏熱帶農業科學研究所和云南省農業科學院熱帶亞熱帶經濟作物研究所三家國內最主要的咖啡種質資源保存單位，收集保存了國內外大部分咖啡主栽品種及遺傳資源，樣本具有足夠的信息量和廣泛的代表性。本研究引物篩選及鑒別驗證所用樣本既包括了當前國內外咖啡主栽品種，如小粒種的卡帝莫7963、卡杜拉、T5175、T8667、波邦、鐵畢卡，中粒種的6號、24號、26號、興28等，這增加了所篩選引物在咖啡商品貿易真偽及種子、苗木種屬類別鑒別過程中的適用性；同時也包括了不同種源、不同性狀，遺傳差異顯著的種質樣本，如來自巴西、哥倫比亞、危地馬拉、墨西哥、坦桑尼亞、厄瓜多爾、巴布亞新幾內亞、哥斯達黎加、夏威夷、澳大利亞、肯尼亞等國家的不同種源及黃果、紫葉、矮種等性狀顯著差異的樣本，提高了所篩選引物的可靠性和穩定性。

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