基于轉座子突變獲得蘇云金芽胞桿菌解毒Cr（Ⅵ）的相關基因功能分析

摘 要 為了獲得蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis， 簡稱Bt）解毒Cr（Ⅵ）的相關基因并進行功能分析，從Bt 407轉座子隨機突變體庫篩選并獲得了9株Cr（Ⅵ）還原能力突變株，測定了其轉座子插入位點，并研究了表型變化。這些突變株的Cr（Ⅵ）還原能力比野生株極顯著提高（p<0.01），其轉座子插入位點均為編碼假定的肽鏈內切酶yddH基因。研究結果表明，野生株與突變株的生長曲線沒有顯著差異，說明突變株Cr（Ⅵ）還原能力的極顯著提高與菌種數量改變無關。突變株總鉻含量基本保持不變，表明Bt 407主要是通過將Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ）來解毒Cr（Ⅵ）。本研究為構建高效解毒Cr（Ⅵ）工程菌提供了新候選基因材料。

關鍵詞 蘇云金芽胞桿菌；轉座子；肽鏈內切酶； Cr（VI）；還原

中圖分類號 Q939.9 文獻標識碼 A

Functional Analysis of Genes Controlling Detoxification of Cr（Ⅵ） in

Bacillus thuringeinsis with Transposon Mutagenesis

HUANG Tianpei1，ZHANG Jun1，KANG Rong1，LAI Xiaohua1，

PAN Jieru2，ZHANG Lingling1，3，GUAN Xiong1*

1 Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology， Ministry of Education， Fujian Agriculture

and Forestry University， Fuzhou，Fujian 350002， China

2 Fuzhou Center for Disease Control and Prevention， Fuzhou， Fujian 350004， China

3 China National Engineering Research Center of Juncao Technology， Fujian Agriculture and

Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract In order to analyze the functions of genes controlling detoxification of Cr（Ⅵ） in Bacillus thuringeinsis with transposon mutagenesis， the mutants with different Cr（Ⅵ） reduction capacity were obtained from a library of Bt 407 transposon random insertion mutants. The insertion sites and the phenotypes of the mutants were then determined. 9 mutants which Cr（Ⅵ）-reducing capacities were remarkably different（p<0.01） from Bt 407 were obtained. The flanking sequence of mini-Tn10 insertion in the mutants was sequenced and within putative endopeptidase yddH gene. The results showed that the growth curves of all strains were similar. This indicated that strain populations did not affect the Cr（Ⅵ） reduction capacities of the mutants. The observation that total Cr of Bt 407 and its 9 mutants were similar and waved among 50 mg/L suggested that they mainly detoxify Cr（Ⅵ） by reduction. Herein， the putative endopeptidase yddH gene might be a novel gene for construction of engineering strains detoxifying Cr（Ⅵ） with high efficiency.

Key words Bacillus thuringiensis；Transposon； Endopeptidase；Cr（Ⅵ）；Reduction

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.019

鉻是電鍍等制造業的副產品，在環境中會積累，并可能影響土壤肥力和微生物活動，造成作物產量損失[1-3]。廢水中的鉻存在形式主要有Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）2種，其中， 以Cr（Ⅵ）的毒性最大， 約Cr（Ⅲ）的1 000倍[2]。把有毒性的Cr（Ⅵ）還原成Cr（Ⅲ），是處理含鉻廢水最常用的方法之一[4]。其中，細菌處理法越來越引起人們的重視[5]。研究已發現許多細菌在有氧/無氧條件下具有將Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ）的能力[6-8]。大部分的細菌Cr（Ⅵ）還原為酶促反應[9]。在有氧條件下，Cr（Ⅵ）還原酶以內源電子、NADPH、NADH作為電子供體來還原Cr（Ⅵ）[10]。許多Cr（Ⅵ）還原酶隨著科學的發展不斷被鑒定，如硫辛酰脫氫酶、谷胱甘肽還原酶等。這些酶一般都具有NADH：黃素氧化還原酶活性，以Cr（Ⅵ）作為其電子受體，生成黃素半醌和Cr（Ⅴ）[11-12]。另外一類鉻或醌專性的還原酶（ChrR、YieF和NfsA）可以將Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ）[12-16]。

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前研究最為深入、應用最廣泛的微生物殺蟲劑之一。Sahin等[17]和周學永等[18]分別研究了Bt對Cr（Ⅵ）的動力學吸附過程。2010年，黃天培等 [19-20]證明了Bt菌株普遍具有將Cr（Ⅴ）還原為Cr（Ⅲ）的能力，明確了細胞色素氧化酶亞單位I可能參與還原Cr（Ⅵ）的調控。在此基礎上，研究從Bt 407 mini-Tn10轉座子隨機突變體庫獲得了9株Cr（Ⅵ）還原能力極顯著提高的突變株（p<0.01），測定了其轉座子插入位點，并研究了其表型變化，為構建高效解毒Cr（Ⅵ）工程菌奠定了新候選基因的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

3 討論與結論

轉座子作為一類可改造的分子工具，其探索已知基因的新功能和未知基因功能的強大能力隨著功能基因組學研究展開得到人們的青昧。2008年，Branco等[24]將Tn5轉座子隨機突變載體pSUP5011轉化蒼白桿菌5bvl1，建立了一個容量為4 000的突變體庫，鑒定了高度耐鉻的蒼白桿菌5bvl1中鉻抗性基因的轉座位點（TnOtChr），驗證了其中的chrB、chrA、chrC和chrF基因的功能。mini-Tn10轉座子在芽孢桿菌的功能基因組研究中應用非常廣泛。如Ghelardi等[25]利用該mini-Tn10轉座子pIC333發現了編碼Bt鞭毛蛋白的fhlA基因。本研究從基于pIC333構建的Bt407突變體庫中篩選出9株Cr（Ⅵ）還原能力極顯著提高的突變株，根據Bt 407全基因組的預測注釋[26]分析了轉座子mini-Tn10插入位點側翼序列，將插入位點均確認為假定的肽鏈內切酶yddH基因第1 009～1 017 bp的“GTACCTGTA”。已發現枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）肽鏈內切酶YddH可水解細胞壁[27]。將Bt 407肽鏈內切酶YddH氨基酸序列進行BLASTP比較，發現其高度同源序列均注釋為接合轉移蛋白（conjugation protein），與枯草芽孢桿菌肽鏈內切酶YddH同源性很低。因此，該Bt 407基因是否具有肽鏈內切酶功能或接合轉移蛋白功能需要進一步實驗驗證。已知在接合轉移蛋白介導的接合轉移作用下，蠟樣芽胞桿菌組（Bacillus cereus sensu lato family）的細菌間可以進行基因庫之間的交流及協同進化；Bt和蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）可以在河水、土壤、食品、昆蟲腸道中交換遺傳物質；炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）毒素基因或整個毒素質粒可以接合轉移到其他的芽孢桿菌，反之，其他細菌的基因或質粒也可以接合轉移到炭疽芽孢桿菌。這導致人們對利用傳統方法區分炭疽芽孢桿菌與蠟樣芽胞桿菌組細菌正確性的擔心[28]。

Bt是應用最廣泛的微生物農藥之一，也是作物土壤習居菌，對人無致病性，且能高效還原Cr（Ⅵ），是治理Cr（Ⅵ）污染的理想材料之一。本研究基于轉座子技術發現了yddH的缺失可能極顯著提高了Bt對Cr（Ⅵ）還原能力（p<0.01）。因此，轉座子技術可為構建高效解毒Cr（Ⅵ）工程菌構建提供新候選基因資源。后續實驗將利用該基因活性恢復突變體和超表達突變體來確認其對Cr（Ⅵ）還原的調控功能，獲得高效解毒Cr（Ⅵ）工程菌，明確其是否具有肽鏈內切酶功能或接合轉移蛋白功能。

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