臺灣金線蓮細胞懸浮培養及其培養條件優化的研究

王晗等

摘要[目的]研究臺灣金線蓮細胞懸浮培養B5培養基的配方。[方法]以新鮮葉片為材料，經過初代培養、固體培養和繼代培養，建立懸浮細胞培養體系，正交設計試驗優化培養基配方。[結果]B5培養基中，影響懸浮培養因素的大小依次為大量元素濃度、6BA、2，4D、蔗糖、IAA。[結論]選用2%蔗糖、0.5 mg/L 6BA、0.2 mg/L IAA、0.6 mg/L 2，4D、1/2濃度大量元素的B5培養基培養懸浮細胞，15 d后吸光度達4.425。

關鍵詞臺灣金線蓮；懸浮細胞；培養基；培養條件；優化

中圖分類號S567文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2014）36-12888-02

Abstract [Objective] To investigate B5 medium formula for suspension culture of Anoectochilus frmosanus Hayata cells. [Method] With fresh leaves as material， the culture system of suspension cells was established through primary culture， solid culture and subculture， and culture medium formula was optimized by orthogonal design. [Result] The influence factors of suspension culture in descending order were macroelement， 6BA，2，4D， sucrose， IAA. [Conclusion] The optimum conditions were 2% sucrose， 0.5 mg/L 6BA， 0.2 mg/L IAA， 0.6 mg/L 2， 4D， and semi concentration of macroelement， and culturing with optimal medium after 15 days， the optical density of suspension cells reached 4.425.

Key words Anoectochilus formosanus； Suspension cells； Culture medium； Culture conditions； Optimization

金線蓮 （Anoectochilus formosanus Hayata）為蘭科（Orchidaceae） 開唇蘭屬 （Anoectochilus BI） 中小型地生蘭，有滋補、止痛、鎮咳等功效，可用于治療肺結核咯血、糖尿病、腎炎、膀胱炎、重癥肌無力、遺精、風濕性及類風濕性關節炎、小兒驚風、婦女白帶以及毒蛇咬傷等癥[1-3]，從金線蓮中分離出的金線蓮苷（kinsenoside）具抗腫瘤、降血糖等生理活性[4-5]。野生野金線蓮主要分布在福建臺灣、廣東、廣西和西藏等地，由于其性喜陰涼、弱光、腐殖質豐富的環境，加上自然的繁殖率低，所以野生資源極其稀缺，而采用大規模的發酵培養，也許是解決這些問題有效的途徑之一[6-7]。筆者以新鮮葉片為材料，經過初代培養、固體培養和繼代培養，建立懸浮細胞培養體系，正交設計試驗優化培養基配方。

1材料與方法

1.1材料

臺灣金線蓮新鮮葉片采于組織培養瓶中生長旺盛的無菌苗，無菌苗由湖州師范學院生命科學學院實驗室提供。試劑除植物激素為生化試劑，其余為分析純，購于杭州華東醫藥集團有限公司。

1.2儀器 HZ9310K恒溫光照培養搖床、UV1102II紫外可見分光光度計、NIB100倒置顯微鏡等。

1.3方法

1.3.1臺灣金線蓮懸浮培養體系的建立。

1.3.1.1初代懸浮培養。

取臺灣金線蓮葉片，蒸餾水分3次沖洗60 min，酒精70%～75%消毒15～30 s，無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干材料表面水分后放入研缽中，加入緩沖液（20 μmol蔗糖、10 μmol MgCl2、20 μmol TrisHCl，pH=7.8）研磨數分鐘， 61 μm篩網過濾，濾液移入1.5 ml Ep管，離心（5 500 r/min，20 min），沉淀細胞轉入B5液體培養基中培養，光照強度1 500～2 000 lx，光照時間16 h/d、溫度25±1 ℃、轉速120 r/min。

1.3.1.2固體培養。

初代懸浮培養20 d后，取懸浮培養液過61 μm篩網，濾液離心（5 000 r/min， 3 min），沉淀細胞調整細胞密度至104～105個/ml，與40 ℃左右的B5固體培養基搖勻后倒入培養皿中，25 ℃光照培養20 d。

1.3.1.3繼代懸浮培養。

挑取固體培養基平板生長良好的細胞團接入液體B5培養基中培養，光照強度1 500～2 000 lx、光照時間16 h/d、溫度25±1 ℃，轉速120 r/min。

1.3.2臺灣金線蓮細胞懸浮培養條件的優化。

采用L18（35）正交試驗設計[8]，考察B5培養基中大量元素、 蔗糖、吲哚3乙酸（Indole3acetic acid ，IAA）、6芐氨基嘌呤（6Benzylaminopurine， 6BA）、2，4二氯苯氧乙酸（2，4Dichlorophenoxyacetic acid ，2，4D）不同濃度對臺灣金線蓮懸浮培養的影響，各因素的水平表及試驗安排如表1～2所示。取繼代細胞接種于100 ml培養基培養15 d后，483 nm波長測定吸光度。按照正交設計試驗得到的培養基配方，配制5瓶100 ml培養基，接種培養15 d，驗證結果。

效果最好也驗證這一點，至于1/4B5培養基效果差，可能與其營養水平過低有關。植物激素對植物細胞生長、分化再生及代謝產物的形成起到了重要的作用，該研究中使用了6BA、IAA 和2，4D 3種激素，研究結果表明激素對細胞生長速度的影響順序為6BA>2，4D>IAA，其中6BA對生物量的影響僅次于無機鹽，說明臺灣金線蓮生物量的高低與細胞分裂相關度較大。

參考文獻

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