轉基因橡膠樹中載體骨架序列的初步研究

李季 黃天帶 蔡海濱 華玉偉 黃華孫

摘 要 以橡膠樹轉基因材料為研究對象，首次基于載體左右邊界序列設計的特異引物進行載體骨架序列的初步PCR檢測，結果表明，15個轉基因陽性株系中有5個和2個株系分別含有左側和右側的邊界序列，占33.3%和13.3%，結合這些株系PCR產物的序列分析結果進一步證實除T-DNA區以外的載體骨架序列確實整合到這些株系的植物基因組中。同時對載體骨架序列存在的弊端及可能的解決途徑做了相應的分析。

關鍵詞 橡膠樹；轉基因；載體骨架序列；PCR

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

傳統觀點普遍認為在遺傳轉化過程中，T-DNA邊界之外的載體序列或載體骨架序列（vector backbone sequences）不可能轉移至宿主植物細胞中[1]，然而，針對多種物種的轉基因整合模式的研究結果表明，T-DNA區域以外的載體骨架序列經常插入到植物基因組中[2-8]。不過有關骨架序列的整合機制還有待于深入的研究。

研究結果表明，載體骨架序列整合進植物染色體中可能會產生重組熱點或導致異常重組，進而影響目標基因的表達[9]，轉基因后代中也易發生目標位點的丟失與表達沉默等[10-11]。在轉基因植物批準商業化過程中，決策部門要求提供插入到植物染色體上DNA的全部序列信息，且不能含有載體骨架序列[6]；而且非目的基因外源DNA片段的存在是否造成生物安全性尚無定論，這些都給轉基因過程中載體骨架序列的存在產生了負面影響，也成為了目前植物基因工程研究的熱點之一。

橡膠樹轉基因起步相對較晚，目前大多數的研究主要集中在遺傳轉化過程的優化、目的基因的整合及表達情況等方面，對于載體骨架序列的發現及其整合現象還未見相關的研究報道。

本研究在對橡膠樹轉基因植株進行陽性鑒定的同時，首次根據載體左右邊界序列設計特異引物對載體骨架序列進行了初步的PCR分析，結果表明在遺傳轉化過程中，載體骨架序列確實隨著T-DNA區一同轉移至橡膠樹基因組中，這也是目前在橡膠樹遺傳轉化研究中首次報道。由于載體骨架序列的存在可能會影響基因的表達及在批準商業化時不能存在載體骨架序列，因此，有必要對轉基因植物的載體骨架序列進行研究。筆者對橡膠樹轉基因植株中的載體骨架序列進行初步的分析，并對其消除的意義及解決措施做了相應的討論，以期在后續的實驗過程中采取措施加以剔除，達到僅保留目標基因片段與植物染色體融合，最終降低后續的相關風險。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用的實驗材料為本課題組于2007～2009年以橡膠樹（Hevea brasiliensis）花藥愈傷組織為外植體，通過農桿菌介導的遺傳轉化方法獲得的轉基因植株穩定期葉片。26個轉基因株系于2011年11月定植于中國熱帶農業科學院橡膠研究所國家橡膠樹種質資源圃，每個株系定植3株，共成活59株；同時以未轉化花藥胚為初生胚通過次生體胚發生增殖后再生的3株組培苗作為對照株系，總計62株。所有材料均經過載體上的抗生素特異引物檢測以及GUS染色分析的方法確定其是否為陽性單株，共檢測出15個轉基因陽性株系（37份植株），具體檢測結果見文獻報道[12]。Tj200863、TP0828、T2009519、Tj2008171、T2009626和T2009401六個株系經southern檢驗確定目的基因已整合進基因組中（結果未發表），這62株均作為載體骨架序列的分析材料。

PCR反應所需要的Taq酶購于Fermentas公司，100 bp DNA Ladder購于北京全式金生物技術有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit購于OMEGA公司，pMDR-19T vector（TaKaRa）購于大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA制備 葉片（穩定期）基因組DNA的制備方法參照文獻報道的方法[12]。（1）取兩個離心管蓋大小的葉片直接置于研缽中，加入65 ℃預熱的600 μL裂解液，研磨至勻漿狀，轉移勻漿至2.0 mL的離心管內；（2）加入等體積的24 ∶ 1（氯仿 ∶ 異戊醇）進行抽提，無需先用25 ∶ 24 ∶ 1（酚 ∶ 氯仿 ∶ 異戊醇）抽提；（3）加入100 μL的ddH2O和1 μL的RNaseA（10 mg/mL），37 ℃溫浴至DNA完全溶解，不需要進行純化處理，直接置于-20 ℃備用。DNA的提取質量采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 PCR分子檢測 根據表達載體左右邊界（LB和RB）附近區間的序列采用Primer5設計PCR擴增引物（表1），其中1條引物設定在T-DNA邊界區附近（LB引物設計在T-DNA區內，RB引物設計在距離T-DNA邊界區25 bp處），另外1條引物錨定在載體骨架區（圖1）。對于所用的PCR分子檢測引物優先在空白對照、陰性對照以及陽性對照中進行擴增，選擇在空白對照和陰性對照中無擴增產物，僅在陽性對照中能擴增出預期大小的片段的引物進行轉基因植株的檢測。載體骨架序列左右邊界檢測的引物分別命名為TL-L/R和TR-L/R，TL-L/R和TR-L/R擴增的片段大小分別為872 bp和525 bp。引物序列由華大基因合成。

PCR總反應體系為15 μL，組成為10×Taq Buffer 1.5 μL，25 mmol/L Mg2+ 1.2 μL；10 mmol/L dNTPs 0.3 μL；5 U/μL Taq酶0.15 μL；10 μmol/L正反向引物各0.3 μL，上述DNA溶液2 μL，滅菌水補足至15 μL。PCR反應參數為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，引物TL-L/R 67 ℃復性40 s（引物TR-L/R 66 ℃復性40 s），引物TL-L/R 72 ℃延伸1 min（引物TR-L/R 72 ℃延伸40 s），35個循環；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR檢測時，分別以水做空白對照，未經遺傳轉化的橡膠樹葉片基因組DNA為陰性對照，含有目的基因的表達載體質粒為陽性對照。

1.2.3 PCR產物的回收 TL-L/R和TR-L/R兩對引物擴增出轉基因單株的PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇轉基因株系中的一個單株擴增的目標條帶進行挖膠，用E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit（OMEGA）對目的產物回收，并將回收產物取2 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 PCR產物的克隆與序列分析 將PCR產物回收純化后與pMDR-19T vector（TaKaRa）連接，方法參照載體試劑盒說明書。轉化大腸桿菌DH5α，鑒定并挑選至少兩個陽性克隆送至華大基因測序，其中TL-L/R鑒定的轉基因植株進行雙向測序，而TR-L/R鑒定的轉基因植株進行單向測序即可。測序獲得的序列采用LASERGENE 6.0中的Seqman軟件去除載體序列后進行片段拼接。利用MUSCLE 軟件（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）進行序列數據的比對[13]，并用GeneDoc軟件可視化輸出。

2 結果與分析

2.1 PCR分子檢測

上述62份材料的葉片DNA擴增結果表明，TL-L/R引物在15份轉基因陽性植株（代表5個株系）中擴增出872 bp的片段大小，占轉基因陽性株系的33.3%，而非陽性單株和其余22份陽性單株中無擴增產物；TR-L/R引物在6份轉基因陽性植株（代表2個株系）中擴增出525 bp的片段大小，占轉基因陽性株系的13.3%，而在非陽性單株及其余31份陽性單株中無擴增產物。PCR分析的結果顯示，含有左側邊界序列的陽性植株相對較多，而含有右側邊界序列的轉基因植株同時也含有左側的邊界序列，在15個轉基因陽性株系中有2個株系均含有左右邊界的序列。部分樣品檢測的結果如圖2所示，全部植株檢測結果如表2所示。

2.2 生物信息學分析結果

將TL-L/R檢測到的轉基因植株PT55-1、Tj200863-1、Tp0828-1、Tj2008171-1和T2009401-1進行測序，并與pCAMBIA2301載體序列進行比對發現序列完全一致（圖3-A），該比對結果說明這些轉基因植株中確實存在左邊界的序列整合到植物基因組中。同理，將TR-L/R檢測到的兩株轉基因植株PT55-1和T2009401-1進行測序，與pCAMBIA2301載體序列的右邊界區域完全一致（圖3-B），說明這兩株植株中，右邊界的序列也隨著T-DNA區的轉移而轉移至植物基因組中。但在這些植株中，邊界序列插入到基因組中的片段大小目前還在進一步的研究中。

3 討論

載體骨架序列整合進植物染色體中是轉基因植物中的一種普遍現象，并無作物特異性。在擬南芥[3，5，14]、水稻[15]、玉米[16]、煙草[4]、馬鈴薯[17]、棉花[8]和矮牽牛[18]中均有報道。研究結果表明，在農桿菌介導的遺傳轉化過程中，載體骨架序列與植物基因組之間的整合頻率一般在20%～50%之間，有時甚至高達75%以上[4，19-20]。本研究左右邊界整合的頻率分別為33.3%和13.3%，相比他人的研究報道來講，骨架序列存在的比例偏低，可能是由于本研究中利用PCR方法結合測序的方法分析的轉基因陽性株系數目有限，僅為15個株系，因此還需要更多的轉基因陽性株系來評估橡膠樹中載體骨架序列的轉移比率。

目前，對于載體骨架序列整合進植物染色體的原因還沒有得到一致的結論，T-DNA鏈從LB處起始覆蓋載體骨架亦或是在RB處開始形成的T-鏈在載體的LB處終止失敗而最終造成通讀（read-through），這兩方面的推測均有相關的報道[3，6-7，21-22]。

本研究中發現轉基因陽性植株中檢測到左邊界序列的株系明顯高于右邊界序列（分別為33.3%和13.3%），這與De Buck等[6]的研究結果較為一致，載體骨架DNA多與左側邊界序列而非右側邊界串聯，且有很高比率的轉化子含有與左右邊界均相連的載體DNA序列。而本研究還發現左右邊界序列均有部分整合在植物染色體上的現象，且含有右邊界序列的株系均同時含有左邊界序列，這與Wenck 等[5]的研究結果一致，右邊界載體骨架序列的整合必然會伴隨著左邊界序列的整合，進而形成整個載體的全部整合。但由于本研究檢測過程中所使用的引物只是距離兩側邊界序列較近的引物，因此對于這些轉基因植株中是否含有整個的載體序列，還將進一步設計相對較遠的引物或者利用Tail-PCR的方法確定這些檢測到的轉基因陽性株系插入骨架載體片段的大小。目前已經獲得少數植株側翼序列的結果（利用Tail-PCR法獲得的PT55-1、T2009401-1左右序列，與本研究中的PCR結果和測序分析的結果一致，均為載體骨架區序列；獲得的HbCBF1-3左右序列經分析發現均為非載體骨架序列，將獲得的側翼序列與橡膠樹基因組比較發現為橡膠樹基因組序列，表明該植株僅為T-DNA區插入到橡膠樹染色體上，并根據生物信息學分析獲得該插入基因全長，為功能未知基因），其余植株的Tail-PCR仍在進行中。待這些側翼序列均獲得后，可以對所有的插入位點側翼序列進行生物信息學分析，初步尋找橡膠樹基因組序列中外源基因整合位點的特征，初步分析整合位點的純合性（目前，根據側翼序列以及基因特異性引物組合進行PCR擴增，推測獲得的轉基因植株HbCBF1-3為整合位點雜合子）、T-DNA插入是否存在偏愛性（預示基因組該段DNA序列易于外源基因插入）或是隨機整合性，為外源基因在橡膠樹轉基因植株中整合機制的研究和轉基因效率的提高具有重大的意義。

正因為載體骨架序列存在可能會導致一系列的問題存在[6，9-11]，因此對其成功的剔除顯得尤為重要。目前己有或者正在嘗試多種方法來剔除載體骨架序列，如對表達載體進行改造，即設計和使用較小的雙元表達載體用于遺傳轉化[23]或篩選只含有T-DNA區的轉基因植株，即構建含非T-DNA區致死基因的載體，篩選或富集只含有T-DNA序列的轉基因后代等[24-25]。不過大多數減少載體非必需DNA序列的方法主要用于煙草和擬南芥等模式植物中，真正普遍應用于轉基因植物還需要很長一段時間[26]。對于橡膠樹而言，載體骨架序列的發現，要求我們必須對其進行改造剔除，目前本研究室已經開展設計和使用較小的載體進行遺傳轉化，還可以嘗試參照模式植物T-DNA區致死基因的載體研究的思路進行優化，以期獲得僅含有T-DNA區的轉基因植株。

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