隱花色素基因CRY2延遲擬南芥營養生長時相轉變

蔣瑋琳　龍鴻

摘 要 高等植物的胚后發育經歷了2個重要的時相轉變，即營養生長時相轉變與成花轉變。這2個轉變都受到內源因子與外源因子的綜合調控。調控這兩個轉變的基因網絡存在共同的因子，如部分SPL家族基因。以擬南芥葉片遠軸面表皮毛的出現和miR156的表達量為形態和分子生物學標志，研究參與成花轉變的光受體基因CRY2對營養時相轉變的影響，結果表明CRY2影響營養生長時相轉變，突變體cry2-1的營養生長時相轉變推遲。

關鍵詞 擬南芥；營養生長時相轉變；光受體；CRY2

中圖分類號 Q945 文獻標識碼 A

Abstract Higher plants undergo two important phase transitions， including the vegetative phase change and the reproductive phase transition during its postembryonic development. Both of them are mediated by an integration of internal and external factors. The gene networks regulating the vegetative phase change and the reproductive phase transition share some regulatory elements， such as partial SPL genes. The effect of CRY2， a photoreceptor essential for floral induction， on the vegetative phase change in Arabidopsis thaliana using the onset of abaxial trichomes on rosette leaves as morphological marker and miR156 expression as molecular marker were studied. The results showed that vegetative phase change in cry2-1 mutant was delayed， which indicating CRY2 gene also plays an important role in the vegetative phase change.

Key words Arabidopsis thaliana； Vegetative phase change； Photoreceptors； CRY2

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.019

高等植物生長在種子萌發后經歷了兩個發育轉變，即幼齡期（juvenile）向成熟期（adult）的營養生長時相轉變（vegetative phase change，VPC）和營養生長向生殖生長的成花轉變[1]。擬南芥VPC伴隨著表型的改變，如幼齡期葉為卵圓形、邊緣圓滑且不出現遠軸面表皮毛，而成熟期葉的葉片狹長，邊緣有鋸齒且遠軸面分布有表皮毛[2]。

生理學以及遺傳學的研究已經證明，這兩個發育轉變都受到多種內源因子和外源環境因子的綜合調控。植物營養生長幼齡期中，miR156高表達，隨著發育的進程miR156表達量逐漸下降[3]。miR156通過其目標基因，即SPL轉錄因子家族來瞬時調控VPC。在擬南芥中，SPL3、SPL4和SPL5主要調控開花時間及VPC；SPL9和SPL15主要調控葉起始和VPC[3-4]。超表達miR156的植株幼齡期延長，開花推遲；而超表達SPL3/4/5基因促進VPC與成花誘導[3-4]。

分子遺傳學研究結果表明，各發育時相轉變之間既區別又聯系。許多調控成花起始的基因并不參與VPC，例如terminal flower1-10突變體[5]。相反，一些擬南芥VPC提前的突變體并不提前開花[6]。hasty（hst）突變體既與VPC相關，又參與成花轉變的調控[7]。

光作為最重要的環境因子之一，既為植物提供光合作用的能量，又作為環境信號調控植物的發育周期[8]。光質以及光照度主要通過兩種光受體影響植物發育，紅光/遠紅光受體光敏色素以及藍光受體隱花色素。光受體基因的突變可能導致開花的推遲或提前。研究結果表明，光敏色素PHYB與隱花色素CRY2拮抗作用調控開花調節蛋白CO（CONSTANS）的穩定性[9]，并且PHYB介導紅光抑制開花而CRY2介導藍光抑制PHYB的功能[10]。然而這些基因是否參與VPC調控仍未知。

研究VPC調控機制對于幼齡期較長的植物種類（如木本果樹植物）意義重要，調控其縮短幼齡期，提前開花，可及早產生經濟效益。本研究通過cry2功能缺失突變體來探討CRY2對VPC的影響，為光調控植物營養生長發育過程提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料和培植方法

擬南芥Col生態型的種子由作物遺傳改良國家重點實驗室須健教授課題組惠贈，WT-Col背景下的cry2-1突變體的種子購自Arabidopsis Biological Resource Center at Ohio State University（Columbus， Ohio）。

種子在4 ℃條件下春化3 d，然后點種至小塑料盆中，做好標簽，蓋上保鮮膜以保濕，長日照條件下培養7 d后揭膜。培養條件為營養土 ∶ 蛭石=3 ∶ 2，使用前滅菌，并用蒸餾水充分浸泡，每3 d澆水一次。長日照培養條件為22 ℃，光照16 h，暗培養8 h；植株的生長時間從播種當天開始計算。

1.2 方法

種子萌發后，開始觀察表型，記錄植株的生長速率。統計長日照（LD）生長條件下生長的野生型及相應背景突變體的幼齡葉數目，總蓮座葉數目以及出現可見花芽的時間等。并進行葉形分析。

使用反轉錄PCR（RT-PCR）檢測MIR156a的轉錄水平；熒光定量PCR（Q-PCR）檢測miR156的表達量。鑒于miR156維持植株幼齡性狀，促進幼齡葉的產生，本研究從植株開始出現第一對真葉（即第一對營養葉）起，每3 d取材1次。Trizol（北京全式金生物技術有限公司）法提取植株的總RNA，DNase I（RNase free， TaKaRa公司）去除總RNA中的DNA。miR156的Q-PCR以U6為內參，SYBRR PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit試劑盒（TaKaRa公司）進行加尾法反轉錄與Q-PCR。寡聚引物核苷酸序列如下：miR156-RT-S： 5′-GGCTGACAGAAG

AGAGTGAG-3′，U6-RT-S： 5′-CGGGGACATCCGA

TAAAATT-3′，U6-RT-A： 5′-GATTTATGCGTGTCA

TCCTTGC-3′。

2 結果與分析

2.1 CRY2突變延長擬南芥的生長周期

長日照（LD）生長條件下的cry2-1突變體與Col野生型植株的生長周期具有差異（圖1）。結果表明，在LD條件下，Col型植株生長22 d即可抽薹轉變為生殖生長，而cry2-1植株的營養生長延長了10 d，其蓮座葉的總數量也幾乎是Col野生型植株的2倍（表1），說明CRY2基因突變延遲了擬南芥的營養生長（圖1）。

2.2 蓮座葉遠軸面表皮毛出現顯示營養生長時相轉變被延遲

幼齡期與成熟期所產生的葉片具有形態差異，幼齡期的葉片不具有遠軸面表皮毛，而成熟期葉片開始出現表皮毛[7]。cry2-1突變體與Col野生型植株出現葉片遠軸面表皮毛的葉片數目不同（表1）。結果表明，Col植株開始出現遠軸面表皮毛的葉數目為8.0，而cry2-1突變體是9.2，即cry2-1突變體的營養時相轉變比野生型晚1.2個葉間隔期。而cry2-1突變體的總營養生長比Col多14個葉間隔期（表1）。這些結果說明，CRY2突變同時延長了擬南芥的幼齡期與成熟期（圖2）。

2.3 miR156表達水平顯示CRY2突變導致營養生長時相轉變推遲

反轉錄PCR（RT-PCR）顯示，在Col與cry2-1植株中MIR156a的轉錄水平都隨著生長進程呈下降趨勢。并且當植株快進入生殖生長期（即Col植株生長到20 d，cry2-1植株生長到26 d）時，RT-PCR已經檢測不到MIR156a的轉錄（圖3）。

進一步的熒光定量PCR檢測結果表明，cry2-1突變體中miR156的表達量遠遠低于Col野生型植株（圖4）。而cry2-1突變體中miR156的低表達量導致遠軸面表皮毛的出現比Col植株晚（圖2）。并且，Col植株在生長15 d時，其miR156的表達量已經降低1倍多，而cry2-1突變體植株生長18 d后miR156的表達量才降低1倍。說明在相同的生長時間內，野生型植株miR156表達量的下降更快，比cry2-1突變體植株更早完成VPC過程，即cry2-1突變體的VPC相對于野生型植株推遲。

3 討論與結論

高等植物在發育過程中必須經歷一個VPC的過程，由幼齡期轉變為成熟期后才具備生殖能力。擬南芥葉片遠軸面表皮毛的產生是易于觀察的VPC形態標志[5]。一些miRNA也參與VPC的調控，其中最主要的是miR156和miR172[3]。研究結果表明，VPC受到葉片中的某種移動信號分子的調控，這種信號分子能夠抑制幼齡葉原基中miR156的表達[11]。由于葉的發育受到內源營養的限制，內源糖降低miR156的表達量，降低光合效率可增加miRNA的量[12-13]。蔗糖在植物組織中可以通過維管組織移動，抑制miR156的表達，很有可能就是這種移動的葉源信號[12-13]。關于VPC調控雖已有一些結論，其機制仍不清楚。

研究結果表明，擬南芥生長在12、8、4或3 h的光周期條件下，當光照不足時，淀粉的合成增加，降解下降，蘋果酸與延胡索酸含量下降，蛋白總量下降以及相關生長率下降[14]。在幼苗中，光受體的主要功能是促進營養生長和積累光合產物。這些光受體還抑制生殖發育，直到植物足夠成熟。這與PHYB、PHYC、PHYD和PHYE基因的突變都導致突變體植株開花比野生型早相一致[15]。筆者的研究結果表明，Col植株在15 d時生長7片蓮座葉，cry2-1突變體植株在18 d時生長9片蓮座葉；而Col植株與cry2-1突變體植株的幼齡葉數目分別為7.0與8.6，說明Col植株在生長15 d時出現遠軸面表皮毛，而cry2-1突變體植株在生長18 d后開始出現遠軸面表皮毛，因此Col植株生長很有可能在15 d左右出現VPC，而cry2-1突變體植株的VPC則可能在生長18 d后發生。Col植株在生長15 d時，其miR156的表達量已經降低1倍多（p<0.01， n=3， ±SD），而cry2-1突變體植株生長18 d后miR156的表達量才降低1倍（p<0.01， n=3， ±SD）；也表明CRY2基因突變推遲VPC進程。由于CRY2作為光受體直接感受光刺激，同時也是調控開花的主要光受體之一，筆者推測CRY2與PHYB互為拮抗作用，成為調控VPC的因子。CRY2與PHYB參與開花調控的研究結果表明，擬南芥的生長存在一個光質敏感期，即種子萌發后的1～7 d。只有在此期間，將Col植株從開花促進的藍光條件轉變為開花抑制的紅光條件可以導致開花時間顯著推遲[9]。擬南芥中只有葉肉組織中的PHYB能夠通過抑制維管束中FT（FLOWERING LOCUS T）的表達達到抑制開花的結果，且只有維管束中表達的CRY2參與調控開花[16]。關于光受體對VPC的影響，還有待于從光質、光照強度以及組織特異性表達等方面進行研究。

參考文獻

[1] Baurle I， Dean C. The timing of developmental transitions in plants[J]. Cell， 2006， 125（4）： 655-664.

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[4] Wu G， Poethig R S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3[J]. Development， 2006， 133（18）： 3 539-3 547.

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[10] Mockler T C， Guo H， Yang H， et al. Antagonistic actions of Arabidopsis cryptochromes and phytochrome B in the regulation of oral induction[J]. Development， 1999， 126： 2 073-2 082

[11] Yang L， Conway S R， Poethig R S. Vegetative phase change is mediated by a leaf-derived signal that represses the transcription of miR156[J]. Development， 2011， 138（2）： 245-249

[12] Yu S， Cao L， Zhou C M， et al. Sugar is an endogenous cue for juvenile-to-adult phase transition in plants[J]. Elife， 2013， 2： e269.

[13] Yang L， Xu M， Koo Y， et al. Sugar promotes vegetative phase change in Arabidopsis thaliana by repressing the expression of MIR156A and MIR156C[J]. Elife， 2013， 2： e260.

[14] Gibon Y， Pyl E T， Sulpice R， et al. Adjustment of growth， starch turnover， protein content and central metabolism to a decrease of the carbon supply when Arabidopsis is grown in very short photoperiods[J]. Plant Cell Environ， 2009， 32（7）： 859-874.

[15] Yu X H， Lin C T. Light Regulation of Flowering Time in Arabidopsis[M]. //Wada M， Shimazaki K， Iino M. Light Sensing in Plants. Japan： Springer， 2005： 325-332.

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生理學以及遺傳學的研究已經證明，這兩個發育轉變都受到多種內源因子和外源環境因子的綜合調控。植物營養生長幼齡期中，miR156高表達，隨著發育的進程miR156表達量逐漸下降[3]。miR156通過其目標基因，即SPL轉錄因子家族來瞬時調控VPC。在擬南芥中，SPL3、SPL4和SPL5主要調控開花時間及VPC；SPL9和SPL15主要調控葉起始和VPC[3-4]。超表達miR156的植株幼齡期延長，開花推遲；而超表達SPL3/4/5基因促進VPC與成花誘導[3-4]。

分子遺傳學研究結果表明，各發育時相轉變之間既區別又聯系。許多調控成花起始的基因并不參與VPC，例如terminal flower1-10突變體[5]。相反，一些擬南芥VPC提前的突變體并不提前開花[6]。hasty（hst）突變體既與VPC相關，又參與成花轉變的調控[7]。

光作為最重要的環境因子之一，既為植物提供光合作用的能量，又作為環境信號調控植物的發育周期[8]。光質以及光照度主要通過兩種光受體影響植物發育，紅光/遠紅光受體光敏色素以及藍光受體隱花色素。光受體基因的突變可能導致開花的推遲或提前。研究結果表明，光敏色素PHYB與隱花色素CRY2拮抗作用調控開花調節蛋白CO（CONSTANS）的穩定性[9]，并且PHYB介導紅光抑制開花而CRY2介導藍光抑制PHYB的功能[10]。然而這些基因是否參與VPC調控仍未知。

研究VPC調控機制對于幼齡期較長的植物種類（如木本果樹植物）意義重要，調控其縮短幼齡期，提前開花，可及早產生經濟效益。本研究通過cry2功能缺失突變體來探討CRY2對VPC的影響，為光調控植物營養生長發育過程提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料和培植方法

擬南芥Col生態型的種子由作物遺傳改良國家重點實驗室須健教授課題組惠贈，WT-Col背景下的cry2-1突變體的種子購自Arabidopsis Biological Resource Center at Ohio State University（Columbus， Ohio）。

種子在4 ℃條件下春化3 d，然后點種至小塑料盆中，做好標簽，蓋上保鮮膜以保濕，長日照條件下培養7 d后揭膜。培養條件為營養土 ∶ 蛭石=3 ∶ 2，使用前滅菌，并用蒸餾水充分浸泡，每3 d澆水一次。長日照培養條件為22 ℃，光照16 h，暗培養8 h；植株的生長時間從播種當天開始計算。

1.2 方法

種子萌發后，開始觀察表型，記錄植株的生長速率。統計長日照（LD）生長條件下生長的野生型及相應背景突變體的幼齡葉數目，總蓮座葉數目以及出現可見花芽的時間等。并進行葉形分析。

使用反轉錄PCR（RT-PCR）檢測MIR156a的轉錄水平；熒光定量PCR（Q-PCR）檢測miR156的表達量。鑒于miR156維持植株幼齡性狀，促進幼齡葉的產生，本研究從植株開始出現第一對真葉（即第一對營養葉）起，每3 d取材1次。Trizol（北京全式金生物技術有限公司）法提取植株的總RNA，DNase I（RNase free， TaKaRa公司）去除總RNA中的DNA。miR156的Q-PCR以U6為內參，SYBRR PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit試劑盒（TaKaRa公司）進行加尾法反轉錄與Q-PCR。寡聚引物核苷酸序列如下：miR156-RT-S： 5′-GGCTGACAGAAG

AGAGTGAG-3′，U6-RT-S： 5′-CGGGGACATCCGA

TAAAATT-3′，U6-RT-A： 5′-GATTTATGCGTGTCA

TCCTTGC-3′。

2 結果與分析

2.1 CRY2突變延長擬南芥的生長周期

長日照（LD）生長條件下的cry2-1突變體與Col野生型植株的生長周期具有差異（圖1）。結果表明，在LD條件下，Col型植株生長22 d即可抽薹轉變為生殖生長，而cry2-1植株的營養生長延長了10 d，其蓮座葉的總數量也幾乎是Col野生型植株的2倍（表1），說明CRY2基因突變延遲了擬南芥的營養生長（圖1）。

2.2 蓮座葉遠軸面表皮毛出現顯示營養生長時相轉變被延遲

幼齡期與成熟期所產生的葉片具有形態差異，幼齡期的葉片不具有遠軸面表皮毛，而成熟期葉片開始出現表皮毛[7]。cry2-1突變體與Col野生型植株出現葉片遠軸面表皮毛的葉片數目不同（表1）。結果表明，Col植株開始出現遠軸面表皮毛的葉數目為8.0，而cry2-1突變體是9.2，即cry2-1突變體的營養時相轉變比野生型晚1.2個葉間隔期。而cry2-1突變體的總營養生長比Col多14個葉間隔期（表1）。這些結果說明，CRY2突變同時延長了擬南芥的幼齡期與成熟期（圖2）。

2.3 miR156表達水平顯示CRY2突變導致營養生長時相轉變推遲

反轉錄PCR（RT-PCR）顯示，在Col與cry2-1植株中MIR156a的轉錄水平都隨著生長進程呈下降趨勢。并且當植株快進入生殖生長期（即Col植株生長到20 d，cry2-1植株生長到26 d）時，RT-PCR已經檢測不到MIR156a的轉錄（圖3）。

進一步的熒光定量PCR檢測結果表明，cry2-1突變體中miR156的表達量遠遠低于Col野生型植株（圖4）。而cry2-1突變體中miR156的低表達量導致遠軸面表皮毛的出現比Col植株晚（圖2）。并且，Col植株在生長15 d時，其miR156的表達量已經降低1倍多，而cry2-1突變體植株生長18 d后miR156的表達量才降低1倍。說明在相同的生長時間內，野生型植株miR156表達量的下降更快，比cry2-1突變體植株更早完成VPC過程，即cry2-1突變體的VPC相對于野生型植株推遲。

3 討論與結論

高等植物在發育過程中必須經歷一個VPC的過程，由幼齡期轉變為成熟期后才具備生殖能力。擬南芥葉片遠軸面表皮毛的產生是易于觀察的VPC形態標志[5]。一些miRNA也參與VPC的調控，其中最主要的是miR156和miR172[3]。研究結果表明，VPC受到葉片中的某種移動信號分子的調控，這種信號分子能夠抑制幼齡葉原基中miR156的表達[11]。由于葉的發育受到內源營養的限制，內源糖降低miR156的表達量，降低光合效率可增加miRNA的量[12-13]。蔗糖在植物組織中可以通過維管組織移動，抑制miR156的表達，很有可能就是這種移動的葉源信號[12-13]。關于VPC調控雖已有一些結論，其機制仍不清楚。

研究結果表明，擬南芥生長在12、8、4或3 h的光周期條件下，當光照不足時，淀粉的合成增加，降解下降，蘋果酸與延胡索酸含量下降，蛋白總量下降以及相關生長率下降[14]。在幼苗中，光受體的主要功能是促進營養生長和積累光合產物。這些光受體還抑制生殖發育，直到植物足夠成熟。這與PHYB、PHYC、PHYD和PHYE基因的突變都導致突變體植株開花比野生型早相一致[15]。筆者的研究結果表明，Col植株在15 d時生長7片蓮座葉，cry2-1突變體植株在18 d時生長9片蓮座葉；而Col植株與cry2-1突變體植株的幼齡葉數目分別為7.0與8.6，說明Col植株在生長15 d時出現遠軸面表皮毛，而cry2-1突變體植株在生長18 d后開始出現遠軸面表皮毛，因此Col植株生長很有可能在15 d左右出現VPC，而cry2-1突變體植株的VPC則可能在生長18 d后發生。Col植株在生長15 d時，其miR156的表達量已經降低1倍多（p<0.01， n=3， ±SD），而cry2-1突變體植株生長18 d后miR156的表達量才降低1倍（p<0.01， n=3， ±SD）；也表明CRY2基因突變推遲VPC進程。由于CRY2作為光受體直接感受光刺激，同時也是調控開花的主要光受體之一，筆者推測CRY2與PHYB互為拮抗作用，成為調控VPC的因子。CRY2與PHYB參與開花調控的研究結果表明，擬南芥的生長存在一個光質敏感期，即種子萌發后的1～7 d。只有在此期間，將Col植株從開花促進的藍光條件轉變為開花抑制的紅光條件可以導致開花時間顯著推遲[9]。擬南芥中只有葉肉組織中的PHYB能夠通過抑制維管束中FT（FLOWERING LOCUS T）的表達達到抑制開花的結果，且只有維管束中表達的CRY2參與調控開花[16]。關于光受體對VPC的影響，還有待于從光質、光照強度以及組織特異性表達等方面進行研究。

參考文獻

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