福州旗山野生蕉Musa spp. AB Group試管苗Mn—SOD基因克隆及生物信息學分析

張銳　賴鐘雄

摘 要 以旗山野生蕉（Musa spp.，AB group）試管苗幼嫩葉片為材料，利用RT-PCR結合RACE技術克隆獲得野生蕉試管苗Mn-SOD基因cDNA序列。結果表明：旗山野生蕉Mn-SOD的cDNA全長序列共831 bp，其中5′UTR為137 bp，3′UTR為151 bp，3′端含有17個poly（A）尾。開放閱讀框（ORF）共有543個堿基組成，編碼181個氨基酸。蛋白理化性質預測結果顯示：Mn-SOD蛋白分子量為20 108.8 u，等電點 7.92，屬于堿性蛋白。

關鍵詞 旗山野生蕉（Musa spp.，AB Group）；試管苗；基因克隆；Mn-SOD基因；生物信息學分析

中圖分類號 Q943.2 文獻標識碼 A

Abstract The young leaves of in vitro plantlets of a wild banan（Musa spp.，AB group）grown in Qishan Mountain of Fuzhou were used as the materials to clone Mn-SOD gene by RT-PCR and RACE technology. The full-length cDNA sequence was 831 bp，containing 137 bp 5′UTR，543 bp open reading frame，encoding 181 amino acids，151 bp 3′UTR，and 3′-end involved 17 poly（A）tails. The prediction of proteins physical and chemical properties showed it belonged to a basic protein with 20 108.8 u and pI7.92.

Key words Wild banana（Musa spp.，AB Group）；In vitro plantlets；Gene cloning；Mn-SOD；Bioinformatics analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.020

正常生命活動中，生物體內活性氧的產生與清除處于動態平衡狀態，這種動態平衡是在超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等多種酶的協同作用下完成的[1]，而超氧化物歧化酶（SOD）則是生物體清除逆境反應所產生的活性氧（ROS）的關鍵酶，廣泛存在于植物、動物、微生物中[2]，在清除活性氧和自由基、保護細胞免受氧化損傷、增加膜結構和功能穩定性、增強植物抗逆性等方面發揮重要作用[3]。根據所含金屬輔基的不同主要分為3類：Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Fe-SOD，Cu/Zn-SOD主要存在于細胞質中，Mn-SOD主要存在于線粒體中，Fe-SOD主要存在于葉綠體中。

抗氧化酶基因是目前已經發現的與植物抗寒性有關的起膜保護作用的抗寒功能蛋白基因。在膜保護酶與抗寒性的研究中，以SOD的研究最多[4]。將外源SOD基因轉到其他植物體內，可以提高逆境條件下植物體內SOD活性，降低脅迫條件下ROS對植物造成的損害，增強植物對各種逆境脅迫的適應性[5]。Bowler等[6]早在1989年就開始研究SOD在耐凍中的作用，該研究把煙草的Mn-SOD cDNA導入苜蓿中，發現轉基因植株的SOD活性增強，認為是Mn-SOD抑制了超氧自由基的產生，從而提高抗寒能力。對桉樹的抗寒性研究也發現，桉樹SOD的活性與其耐寒性有關聯，是桉樹抗寒生理機制中的一個關鍵酶[7]。同時，SOD在植物抗病蟲、抗旱、耐鹽堿、抗澇、抗除草劑等方面也發揮著重要作用[8-9]。

香蕉屬芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa）植物。起源于熱帶亞熱帶地區，生物學特性決定了其極易受寒害的侵襲，嚴重影響香蕉的品質和次年產量。多項研究發現施用外源物質在一定程度上可增加細胞保護酶的活性，提高香蕉抗寒能力[10]，但無法從根本上解決香蕉的寒害問題，也不適用于實際生產。截至目前還沒有真正有效的方法從根本上解決寒害對香蕉造成的損失。栽培香蕉多數是三倍體、具有高度不育性，在生產上主要靠無性繁殖，很難采用傳統的育種方法實現品種改良。因此，要從根本上解決香蕉的寒害問題，最有效的方法就是通過基因工程手段對栽培蕉進行品種改良，提高其抗寒性。呂慶芳等[11]研究發現粉蕉、大蕉（Musa spp.，ABB Group）能抵御0～4 ℃的低溫，而野生蕉的抗寒性則更強，且種類不同抗寒性也存在差異，如福州野生蕉[12]（Musa spp.，AA Group）能耐-2 ℃以下的低溫，而三明野生蕉（Musa spp.，AB Group）能耐-5 ℃以下的低溫[13]。香蕉（Musa spp.，AAA）則根本無法抵御0 ℃以下的低溫。這說明香蕉的抗寒能力在本質上由自身的遺傳物質所決定。

Baum等[14]首次從玉米中克隆得到植物SOD基因。隨后，植物SOD基因的克隆在國內外迅速開展。目前已從水稻、擬南芥、煙草、柑橘、龍眼、小麥等多種植物中克隆得到Mn-SOD基因，部分已通過遺傳轉化驗證了其功能。但該基因在香蕉中的克隆和研究較少，僅發現了香蕉（AAA）中的部分序列及全序列，在GenBank中的登錄號分別為： AF510071.1和AEZ56248.2。目前關于福州旗山野生蕉（Musa spp.，AB Group）的Mn-SOD基因尚未見報道。近年來香蕉基因組測序工作的完成及生物技術的發展為香蕉遺傳改良提供了一定的理論依據。本研究首次從福州旗山野生蕉（Musa spp.，AB Group）中克隆得到Mn-SOD基因的cDNA序列，并對其編碼的氨基酸序列進行預測和分析，為利用基因工程進行香蕉的抗性育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

供試材料為旗山野生蕉（Musa spp.，AB Group）離體保存試管苗幼嫩葉片；菌種DH5α感受態細胞及PCR反應液均購自北京天根生化科技有限公司；植物總RNA通用提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；pMD18-T載體、反轉錄試劑盒3′RACE均購自Fermentas公司；5′RACE購自Invitrogen公司；膠回收試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 野生蕉總RNA提取及cDNA的合成 利用通用植物總RNA提取試劑盒提取野生蕉試管苗幼嫩葉片總RNA，采用Fermentas公司的RevertAidTM First-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成單鏈cDNA，用于保守區、3′RACE 及ORF的擴增；采用Invitrogen公司的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends、Version 2.0試劑盒合成5′RACE cDNA，用于5′RACE的擴增，具體操作詳見說明書。

1.2.2 野生蕉Mn-SOD基因保守區引物設計及PCR擴增 根據GenBank中已經登錄的不同物種Mn-SOD基因高度保守區序列設計特異上游引物Mn-SOD-F和特異下游引物Mn-SOD-R，以保守區cDNA為模板，進行保守區序列的擴增。PCR反應體系為25 μL，其中上下游引物各1 μL，2×Master Mix 12.5 μL，模板1 μL，用ddH2O補足25 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，退火57 ℃（根據擴增結果的不同進行調整），共35個循環，72 ℃延伸40 s，35個循環后72 ℃繼續延伸10 min，于4 ℃下保存備用。

1.2.3 野生蕉Mn-SOD基因3′RACE引物設計及PCR擴增 運用DNAMAN 6.0和primer premier 5.0軟件，根據測序所得到的Mn-SOD基因保守區序列，選擇與其他物種序列相對特異的區域設計2條順式上游引物：3′Mn-SOD-1和3′Mn-SOD-2。以3′RACE cDNA為模板，3′Mn-SOD-1為上游引物，AUAP為下游引物，進行第一輪3′端序列擴增；以第一輪PCR產物為模版，3′Mn-SOD-2為上游引物，AUAP為下游引物，進行第二輪3′端PCR擴增。PCR反應體系及反應程序同保守區。

1.2.4 野生蕉Mn-SOD基因5′RACE引物設計及PCR擴增 運用DNAMAN 6.0軟件將測序所得到的Mn-SOD基因3′端序列與保守區序列進行拼接，與其他物種Mn-SOD基因序列進行比對，選擇與其他物種序列相對特異的區域設計2條反式下游引物：5′Mn-SOD-1和5′Mn-SOD-2，以AUAP為上游引物。采用巢式PCR進行5′端擴增。所用引物名稱、引物序列、目的片段大小及退火溫度見表1。

1.2.5 野生蕉Mn-SOD ORF驗證 用DNAMAN 6.0軟件將所獲得的野生蕉Mn-SOD基因的保守區、3′RACE及5′RACE序列進行拼接可得到全長cDNA序列。根據拼接得到野生蕉Mn-SOD基因全長，在包括起始密碼子ATG和終止密碼子TGA處設計1對特異引物：上游引物ORF-F和下游引物ORF-R，以3′-RACE cDNA為模板進行開放閱讀框的擴增，驗證所克隆的Mn-SOD基因序列的正確性。

1.2.6 產物檢測 以1.0%瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增產物，使用Solarbio公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段，將其連接于載體pMD18-T上，采用熱激法轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，過夜培養后挑選白斑單菌落進行菌液培養；通過菌落PCR（與以cDNA為模板的PCR反應條件相同）對陽性克隆菌株進行檢測，將PCR產物遞交給華大公司進行測序。

1.2.7 生物信息學分析 將測序結果在NCBI中進行在線BLAST，檢測結果的正確性，利用DNAMAN 6.0軟件和ExPASy系統中的ProtParam工具對Mn-SOD基因編碼的蛋白質的理化性質、跨膜結構域、亞細胞定位、磷酸化位點、分子進化等進行預測分析，以進一步了解其結構和功能。

2 結果與分析

2.1 野生蕉葉片總RNA的提取及質量檢測

本研究所提取的總RNA近無色，不呈膠狀，基本上排除了多酚、多糖、蛋白質等污染。經瓊脂糖凝膠電泳檢測可知，無DNA污染，總RNA條帶邊緣整齊，28S和18S的條帶比較清晰，說明通用植物總RNA提取試劑盒所提取的RNA質量好，純度高，可進行后續試驗（圖略）。 2.2 野生蕉Mn-SOD基因序列片段的獲得

以Olig（dT）18 prime進行逆轉錄，將所獲得的cDNA作為模板進行PCR擴增，獲得400 bp左右的單一特異性條帶（圖1-A），測序結果為426 bp，包含上下游引物序列，與預期結果一致。將該序列在GenBank數據庫中進行在線BLAST，結果顯示其與別的物種的Mn-SOD基因在核苷酸序列上高度同源，初步推斷克隆得到的片段為野生蕉Mn-SOD基因的保守區序列。

以3′RACE cDNA為模板，經過2輪PCR擴增，得到500 bp左右的單一條帶（圖1-B），測序結果為509 bp，包含上下游引物序列，與預期片段大小基本相符，終止密碼子為TGA，且具有典型的Poly（A）尾巴和加尾信號“AATAA”。用DNAMAN6.0軟件將該序列與保守區序列進行拼接，2序列片段具有相應的重復區，且該片段與已登錄NCBI的多種Mn-SOD基因高度同源，可認為該片段是野生蕉Mn-SOD基因的3′末端片段。

以5′RACE cDNA為模板，經過2輪巢式PCR擴增，得到約300 bp的單一條帶（圖1-C），測序結果為315 bp，包含起始密碼子ATG。

2.3 野生蕉Mn-SOD基因全長cDNA及ORF驗證

將所獲得的野生蕉Mn-SOD基因cDNA全長序列在GenBank上登錄，登錄號為：JF752346。開放閱讀框（ORF）共由543個核苷酸組成，編碼181個氨基酸（圖2），ATG為起始密碼子，TGA為終止密碼子，包括完整的5′端非編碼區137 bp、3′端非編碼區151 bp及3′端poly（A）尾巴17 bp。

以3′RACE cDNA為模板進行PCR擴增，經測序得到550 bp的cDNA片段（圖1-D），與推斷的ORF序列完全相同，驗證了所克隆的Mn-SOD基因的正確性。

將野生蕉Mn-SOD基因在http：//ncbi.nlm.nih.gov、http：//banana-genome.cirad.fr網站上進行在線BLAST，其與不同物種間Mn-SOD基因的核苷酸序列同源性均比較高，其中該序列與芭蕉屬（JQ364939.2）同源性86%、荔枝（HQ661041.1）同源性79%、擬南芥（AY085319.1）同源性74%、番木瓜（L77078.1）同源性75%、蓖麻屬（XM_002520810.1）同源性74%，與香蕉基因組測序結果中的小果野蕉（Musa acuminata）核苷酸序列同源性高達96.8%，說明本試驗通過RACE克隆的基因是Mn-SOD基因。

2.4 野生蕉Mn-SOD基本理化性質的預測及分析

根據DNAMAN 6.0軟件和ExPASy系統中的ProtParam工具，預測Mn-SOD蛋白的分子量為20 108.8 u，等電點pI為7.92，屬于堿性蛋白；分子式：C917H1402N248O259S2，總原子數為2 828；帶負電的氨基酸有18（Asp+Glu），帶正電的氨基酸有19（Arg+Lys）；消光系數：在280 nm時為50 420。在哺乳動物網狀紅細胞的體外表達半衰期為30 h，在酵母和大腸桿菌中的體內表達的半衰期分別大于20 h和10 h。不穩定系數是25.71，在閾值范圍內，說明該蛋白屬于穩定蛋白；脂肪系數為88.39。總平均疏水性為-0.374，預測該蛋白是親水蛋白（水溶蛋白）。此蛋白質由20種氨基酸組成，其中Ala、Leu、Lys、Gly、Val、Asn、Glu含量較為豐富，分別為20（11.1%）、18（10.0%）、16（8.9%）、15（8.3%）、13（7.2%）、12（6.7%）、10（5.6%），Met含量最少，只有2個（1.1%）。疏水性分析為跨膜結構提供相互驗證的依據。從整體上看，親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，整條多肽鏈表現為親水性。運用PSORT（http：//psort.nibb.ac.jp/）軟件進行亞細胞定位預測與分析可知，Mn-SOD定位在線粒體。推斷野生蕉Mn-SOD基因編碼的蛋白是一種線粒體蛋白。

通過在線BLAST比較野生蕉（Musa spp.， ABGroup）Mn-SOD和其他物種Mn-SOD的氨基酸序列可知，克隆得到的該序列含有2個保守結構域，包括SOD-Fe-N 和 SOD-Fe-C功能結構域，說明該Mn-SOD基因屬于Fe/Mn-SOD超級家族成員。

運用Tmpered（www.ch.embnet.org/software/tepred-form.html）及PSORT（http：//psort.nibb.ac.jp/）在線軟件進行跨膜結構預測可知，僅在多肽鏈131～149（19）處有一個內而外螺旋（Inside to outside helices），但分值太低，僅為265分，沒有超過500分，經推測可知，野生蕉Mn-SOD沒有跨膜結構域，屬于非跨膜蛋白。信號肽是指用于指導蛋白質跨膜轉移的位于分泌蛋白N-末端的氨基酸序列，一般由15～30個氨基酸組成，包括一個帶正電的N末端、以中性氨基酸為主的一個中間疏水序列和一個較長的帶負電荷的C末端。信號肽的作用是指導新合成的多肽鏈進行跨膜轉移，信號肽的預測和分析有助于理解蛋白質亞細胞定位及功能域的劃分。經SignaIP 3.0 Server在線分析可知，Mn-SOD屬于非分泌蛋白，不具信號肽（圖3），這和跨膜結構域預測的結果一致。用NetPhos 2.0 Serve軟件在線對野生蕉Mn-SOD基因編碼的氨基酸進行磷酸化位點預測（圖4），推測野生蕉Mn-SOD磷酸化位點為5個，在1個Ser（在肽鏈第72位）、1個Thr（117位）、3個Tyr（12、151、175位）氨基酸位點處發生磷酸化修飾。在肽鏈第175位的C末端有Tyr磷酸化位點，分值最高，達0.735，推測Tyr 磷酸化位點可能會影響野生蕉Mn-SOD的構象、核定位調節等功能。

應用InterProScan程序搜索位于EBI的InterPro數據庫（圖5）可知，Mn-SOD基因對應的181個氨基酸殘基編碼的蛋白質屬于Fe/Mn-SOD超級家族成員。該家族收錄了大量的蛋白質成員，其中細菌域（bacteria）最多，由4 241個蛋白質成員組成；集胞藻屬、果蠅和病毒最少，分別只有3個成員。通過JPred（http：//www.compbio.dundee.ac.uk/）預測Mn-SOD蛋白的二級結構，其二級結構包括51.11%的α螺旋、8.89%的延伸鏈和40.00%的不規則卷曲（圖6）。

螺旋主要位于C端。縱觀該蛋白的整體結構，α螺旋和不規則卷曲是野生蕉葉片Mn-SOD蛋白最大的結構元件，貫穿于整個蛋白質結構中，而延伸鏈較少，分散其中。利用SWISS-MODEL在線工具對Mn-SOD進行蛋白質三維結構預測，Mn-SOD蛋白有4個β折疊，5個α螺旋。

將所獲得的野生蕉Mn-SOD基因編碼的氨基酸序列與番木瓜（Carica papaya，GenBank登錄號：AAB02052.1）、荔枝（Litchi chinensis，GenBank登錄號：AEK05514.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，GenBank登錄號：AAM62550.1）、蓖麻（Ricinus communis，GenBank登錄號：XP_002520856.1）、天寶蕉（Musa acuminata AAA Group，GenBank登錄號：AEZ56248.2）、基因組測序中的小果野蕉（Musa acuminata1，2，3）等幾個物種的Mn-SOD基因編碼的氨基酸序列進行比對，用MEGA4.1軟件中的NJ法構建系統進化樹（圖7）。從圖中可以看出，9種植物可分為3個大組：5種芭蕉屬植物處于同一分支中，具有很高的同源性，聚為一類的概率為90%；蓖麻單獨為一組；番木瓜、荔枝、擬南芥為一組，聚為一類的概率為76%；克隆所得到的旗山野生蕉（Musa spp.， AB Group）Mn-SOD與基因組測序中的小果野芭蕉（Musa acuminate 1）同源性最高，兩者聚為一類的概率為100%；天寶蕉（Musa acuminata AAA Group）與基因組測序中的小果野芭蕉（Musa acuminate 2）聚為一類的概率為85%。上述結果說明了Mn-SOD在進化過程中的高度保守性及不同物種間該基因的特異性。

3 討論與結論

3.1 Mn-SOD基因功能多樣性

多項研究結果表明，Mn-SOD基因與植物的抗逆性有關，是一種重要的抗氧化劑，具有多種生物學功能。外源Mn-SOD基因的轉入可以提高植物清除活性氧的能力，明顯增強植物的抗性。McKersie等[15-16]將煙草Mn-SOD基因導入苜蓿線粒體中，提高了苜蓿的產量和植株的抗冷性；應用基因槍法將小麥錳超氧化物歧化酶基因（Mn-SOD）導入玉米胚性愈傷組織，獲得的轉基因植株中SOD的活性高于非轉基因植株，明顯提高了轉基因玉米的抗氧化損傷能力[17]；將豌豆錳超氧化物歧化酶導入水稻葉綠體中可以增強轉基因水稻植株的耐旱性[18]；鄧婷婷等[19]將極端耐鹽的鹽生杜氏藻的錳超氧化物歧化酶（DsMnSOD）基因轉染SOD缺陷型大腸桿菌并誘導其表達后發現，該大腸桿菌在耐鹽、耐輻射和抗寒方面的耐受性均明顯提高。上述結果進一步證明了利用轉基因技術將Mn-SOD基因轉入植物基因組，能明顯提高植物的抗逆性。

本課題組多年來對野生蕉的調查研究表明，福州野生蕉（Musa spp.，AA Group）和三明野生蕉（Musa spp.，AB Group）均具有一定程度的抗寒性，三明野生蕉的抗寒性略高于福州野生蕉。張妙霞[20]已對三明野生蕉（Musa spp.，AB Group）抗寒相關基因進行了克隆與表達分析，在功能上進一步驗證了野生蕉可能具有的抗寒性。植物的抗寒性為數量性狀，受微效多基因控制，應該結合多個相關基因進行系統的研究[21-22]。Mn-SOD作為一種抗寒功能蛋白基因，其抗寒性已在多種植物上得到證實，但在野生蕉中尚未見報道，因此從旗山野生蕉中克隆得到Mn-SOD基因并將其轉入栽培蕉基因組，所獲得的轉基因植株很可能會提高栽培蕉的抗寒性，為利用轉基因技術培育香蕉抗寒新品種奠定基礎。

3.2 Mn-SOD蛋白質功能預測與抗寒性

蛋白理化性質預測結果顯示該蛋白是親水蛋白。親水蛋白較高的親水性可避免膜構像發生變化，對維持蛋白質的二級結構具有重要作用，可能在抗凍過程中也起重要作用[20]；蛋白質需要定位在一個或多個亞細胞位置來發揮其職能作用，亞細胞定位顯示該基因定位在線粒體，一些亞細胞結構如線粒體、葉綠體等是細胞內活性氧的主要來源[23]。野生蕉具備較強的抗寒性，可能是由于植株在受到低溫脅迫時，線粒體內高活性的Mn-SOD有效清除了細胞內過多的活性氧和自由基，在調節膜透性、增加膜結構和功能穩定性方面發揮了重要作用，這可能是野生蕉具有一定抗寒性的機理之一。二級結構中α螺旋的比例最大，α螺旋的主要功能是作為蛋白質骨架起穩定作用，而無規則卷曲區則決定蛋白質的功能。有研究認為α螺旋一方面可以和冰晶結合，阻止其他水分子與冰晶結合，從而抑制冰晶生長，另一方面可與其它蛋白質或膜結合，穩定膜功能，防止膜受低溫損傷[24]。關于Mn-SOD在野生蕉生長過程中的功能及其調控機制尚需進一步深入研究。

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