ISSR分子標記鑒定陸川豬及其肉制品

何瑜林

摘 要：采用ISSR分子標記對陸川豬及其肉制品進行鑒偽識別，利用ISSR技術，對純種陸川豬、陸川豬雜交品種（二元雜豬和三元雜豬）及廣西本地的巴馬香豬和環江香豬的DNA指紋圖譜進行分析。結果表明：從34 條引物中篩選出3 條帶型清晰、重復性好的引物WM12、WM27、WM10，其中引物WM12可用于鑒別陸川豬、二元雜豬和三元雜豬的生鮮樣品及臘肉制品，引物WM27可用于鑒別陸川豬和巴馬香豬的生鮮樣品及臘肉制品，引物WM10用可于鑒別陸川豬和環江香豬的生鮮樣品及臘肉制品。ISSR技術可快速準確的鑒定陸川豬、陸川豬雜交品種、巴馬香豬、環江香豬及其肉制品。

關鍵詞：陸川豬；分子標記技術；ISSR

Abstract： In this study， species identification of Luchuan pig meat and meat products was carried out by DNA fingerprint profiling of meats from purebred Luchuan， hybrid Luchuan， Bama miniature and Huangjiang miniature pigs using ISSR （inter-simple sequence repeat） molecular markers. The results showed that 3 clear and repeatable primer pairs WM12， WM27 and WM10 were selected from 34 primers. WM12 was useful for discriminating fresh and cured meat from purebred Luchuan and hybrid Luchuan pigs， while Luchuan pigs could be distinguished from Bama miniature pigs by using WM27， and from Huangjiang miniature pigs by using WM10. In conclusion， the ISSR method enables rapid and accurate identification of fresh meat and meat products from purebred Luchuan， hybrid Luchuan， Bama miniature and Huangjiang miniature pigs.

Key words： Luchuan pigs； molecular marker technology； inter-simple sequence repeat （ISSR）

中圖分類號：TS251.5 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2014）10-0010-05

陸川豬是中國八大地方優良豬種之一，屬于國家級保護品種。因其原產于廣西省東南部的陸川縣而得名。其畜產品可加工成香腸、無皮五花臘肉、白切豬腳、脆皮乳豬、扣肉等肉制品，受到廣大消費者的喜愛。但市場上的陸川豬肉制品真偽難辨，目前針對陸川豬及其雜交品種的肉質研究主要是通過測定豬胴體和肉質特征來評價生鮮肉及其肉制品品質，如瘦肉率、嫩度、pH 值、肉色等，但是由于飼養條件和豬個體存在差異，且測定過程中對供試樣品的采集時間和取樣部位有要求，所以測定結果不穩定不可靠。因此探索快捷、準確的分子標記技術進行陸川豬純種的鑒偽，對陸川豬的發展有重要意義。

DNA分子標記（DNA molecular marker）是以生物大分子的多態性為基礎的一種遺傳標記，它是DNA水平遺傳多樣性的直接反映。DNA多態性在作物的遺傳育種和品種鑒定中已經得到了廣泛的應用。畜牧業方面，黃敏瑞[1]、孫俊麗[2]等利用DNA多態性分析了陸川豬與華南其他品種豬的遺傳進化關系；還有利用DNA分子鑒定技術將牦牛與黃牛等加以區分的報道[3]。ISSR（inter-simple sequence repeat）標記是在SSR基礎上發展起來的一類新型分子標記技術，以其較低的成本、簡單的操作、良好的穩定性、重復性、多態性豐富以及能較好地反映物種的遺傳結構和遺傳多樣性變化等特點，被視為理想的遺傳標記方法，已經廣泛應用在品種鑒定、物種的分類以及居群生物學的研究中[4-5]。但是它在PCR擴增階段需要一定時間來摸索最適反應條件，且是顯性遺傳標記，不能區分顯性純合基因型和雜合基因型。SSR和ISSR技術在食品溯源中主要應用在糧食作物、水果品種、蔬菜品種、動物產品的鑒別以及其他經濟作物如橄欖樹[6]、條斑紫菜等的鑒別中。Nagaraju等[7]用熒光ISSR和熒光SSR方法鑒定Basmati和非Basmati大米，在研究中分別用這兩種方法繪制了指紋圖譜，并進行了聚類分析，結果顯示，這兩種方法都顯示了良好的分辨率、重復性和靈敏度，兩種方法的結合可以很好的將一些品種區分開來。Montemurro等[8]采用SSR和擴增片斷長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）法鑒定112 個油橄欖品種，從27 條SSR引物中得到多態性圖譜引物對樣品進行實驗，并從AFLP引物序列中篩選出3對引物用于區分所有112 個樣品。目前，用DNA分子鑒定技術來鑒別肉制品源性的研究并不多，特別是用于陸川豬及其產品的真偽鑒別的研究較少。鑒于目前的研究現狀以及對陸川豬品牌產品的保護，本課題提取陸川豬及其雜交品種、巴馬香豬和環江香豬及其肉制品的總DNA，用ISSR法分析DNA多態性，探索可用于鑒偽識別的陸川豬的檢驗方法，開發陸川豬及其肉制品的DNA分子鑒定技術。這對規范陸川豬市場和深加工企業的經營行為，引導深加工企業的健康發展以及維護“陸川豬”品牌形象具有重要意義。

2 結果與分析

2.1 DNA提取結果與分析

采用改良后的SDS法提取樣品的DNA，經過純化回收后，通過凝膠電泳檢測得到的條帶比較清晰，片段大小一致，無降解現象，無明顯的RNA條帶干擾和污染。經過DNA純度檢測，所提DNA樣品OD260 nm/OD280 nm比值均在1.7～2.0之間，表明DNA純度能滿足后續ISSR反應的需要。

由于臘肉制品特別是扣肉制品在制作過程中經過將近200 ℃的高溫油炸，DNA破壞比較嚴重，這也給提取造成一定困難，但用此方法提取到的臘肉制品的DNA質量較好，與生鮮肉提到的DNA質量相差無幾，且方法簡單、操作方便、成本低廉，比文獻[16]中提到的采用試劑盒、異硫氰酸胍法[17]、酚-氯仿抽提法[18]等方法更加實用和簡單。

2.2 樣品的ISSR檢測結果與分析

2.2.1 純種陸川豬及其雜交品種ISSR檢測結果與分析

實驗分別對生鮮豬肉和臘肉制品進行了PCR擴增和帶型分析，在設計合成的34 個引物中，篩選出了1 個多態性好，條帶清晰的引物（WM12：5-CTCCTCCTCGC-3）可用于區別陸川豬、二元雜豬和三元雜豬。如圖1所示，引物WM12在陸川豬與二元雜豬、三元雜豬樣品擴增獲得900～1 000 bp特異帶，其在二元雜豬、三元雜豬均有出現，而陸川豬沒有此條帶產生。同樣的結果也出現在陸川豬與二元雜豬、三元雜豬的扣肉樣品中，在大約900 bp處，5 頭陸川豬均沒有條帶產生，而其他的長陸二元雜、大陸二元雜、外三元雜、龍寶豬和內三元雜均有一條比較清晰的條帶產生。說明此引物能夠將陸川豬與二元雜豬、三元雜豬的生鮮樣品和臘肉樣品區分。

在34 個引物中，篩選出了1 個引物（WM10：5-CACCACCACGC-3）用于區別陸川豬和環江香豬。如圖3所示，引物WM10在陸川豬與環江香豬生鮮肉樣品擴增獲得800～900 bp之間和500～600 bp之間2 條特異帶，陸川豬生鮮樣品均有這兩條特異帶，而在環江香豬生鮮肉樣品中均沒有這兩條特異條帶。而在陸川豬與環江香豬臘肉制品電泳圖譜中，在900 bp有特異帶，在陸川豬臘肉樣品中均有出現，但是在環江香豬臘肉樣品中沒有出現。說明引物能夠將陸川豬和環江香豬的生鮮樣品和臘肉樣品區分。

3 討 論

陸川豬的養殖已從過去的農戶散養發展成現在規模化的養殖，肉制品加工產業也得到了迅速的發展。但是，市場上利用雜交豬冒充陸川豬的現象卻層出不窮。傳統的胴體品質和肉質品質評價可以大致體現陸川豬與其他品種豬的差別[19]，但卻沒有嚴格的界限，難以作為區別陸川豬及其他品種豬的標準。胴體品質包括宰前活質量、胴體質量、胴體長、屠宰率、瘦肉率、眼肌面積、膘厚、皮厚、骨質量等指標；肉質指標包括肉色、系水力、嫩度、pH值、大理石紋、肌肉脂肪、肌纖維直徑、游離氨基酸含量等指標。一般的質檢人員在實際操作中很難根據這些指標鑒別陸川豬肉的真偽。首先，供試樣品不易獲得，測定胴體指標需要對整頭豬胴體進行評價；測定肉質指標時，對豬的年齡、性別、樣品部位、宰后時間有嚴格的要求，這對于實驗操作特別是市場采樣是不現實的。再者，這些指標均受飼養條件和個體差異的影響，往往是不穩定的，沒有統一的鑒別標準。另外，對加工變形后臘肉制品更是無法檢測。

而分子標記技術直接以DNA的形式表現，具有很高的穩定性，在生物體的各個組織及各個發育階段均穩定存在，不受取樣部位、年齡、生長條件等的限制。分子標記技術操作簡便，價格低廉，準確度高，結果穩定可靠，易于實現標準化，檢測時間短，檢測樣品多，一次可對100多份樣品同時進行檢測，具有高效、快捷、實用性強的優點[20]。隨著科技的進步，分子標記技術也在不斷的發展和完善。ISSR 技術的應用在動物遺傳結構研究的相關領域也逐漸被采納[21]。本實驗利用ISSR技術探索一種可以快速準確的對陸川豬及其肉制品進行真偽鑒定的方法。

ISSR技術中，引物的設計具有隨機性和其擴增結果具有不可預見性。一般要設計大量候選引物，而最終有效的引物卻為數極少。本研究設計了34 條，從中獲得3 條有效引物。其中，引物WM12（5-CTCCTCCTCGC-3）能夠區分陸川豬與其二元雜豬、三元雜豬；引物WM27（5-CTCCTCCTCAT-3）可以區分陸川豬和巴馬香豬的生鮮樣品及臘肉制品；引物WM10（5-CACCACCACGC-3）可用于區分陸川豬與環江香豬。韓曉磊等[22]從77 個ISSR引物中選出3 條引物對同為雅羅魚亞科魚類的鯰魚、草魚及赤眼鱒的DNA進行擴增，得出ISSR技術可以對形態特征差異不明顯的鯰魚、草魚和赤眼鱒進行分子水平的區分鑒定，與本實驗的研究有相同之處。筆者也注意到，同是陸川豬樣品，其擴增得到的帶型并不完全一致，這也體現了陸川豬這一品種內具有一定的遺傳多樣性，雖然如此，但是從陸川豬與其他品種的豬肉制品的各個電泳圖譜中可以清晰的看到其他豬肉制品具有特異帶，陸川豬是沒有的，可以依據這些特異性條帶對陸川豬進行鑒定。

4 結 論

綜上所述，利用ISSR技術可快速準確的鑒定陸川豬、陸川豬雜交品種、巴馬香豬、環江香豬及其肉制品。研究結果對規范陸川豬市場和深加工企業的經營行為，引導深加工企業的健康發展以及維護“陸川豬”品牌形象具有重要的意義，同時也為廣西地方豬的育種和標準化養殖提供參考，也希望能為其他肉類產品的鑒偽識別提供可借鑒的技術方法。

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