尖孢鐮刀菌古巴?；蚮gb1基因敲除突變體的構建與表型分析

摘 要 為了研究尖孢鐮刀菌古巴?；虶蛋白β亞基編碼基因fgb1的功能，構建fgb1基因敲除突變體，分析fgb1敲除突變體的表型。結果表明：敲除fgb1基因導致突變體菌落在PDA培養基上生長減慢，產孢量和菌絲分枝減少；致病性測定結果表明fgb1基因敲除突變體對巴西蕉的致病性減弱；用激光共聚焦顯微鏡觀察感病香蕉根系，發現fgb1基因敲除突變體仍可在根系維管束中定殖。本研究結果為進一步研究G蛋白信號傳導途徑在尖孢鐮刀菌古巴專化型中的作用奠定了基礎 。

關鍵詞 尖孢鐮刀菌古巴?；?；G蛋白；致病性；生長；發育

中圖分類號 Q789 文獻標識碼 A

Abstract To investigate the function of the G-protein gene fgb1 in the banana fungal pathogen Fusarium oxysporum f. sp. cubense（Foc），the fgb1 deletion mutants were constructed. Phenotypical analysis revealed that deletion of fgb1 gene led to several alterations including slower growth rate on potato dextrose agar（PDA）plates，reduced conidiation and less branches of mycelia compared to the wild-type strain. The fgb1 deletion mutants showed decreased pathogenicity to the banana（Musa spp. cv. Brazil），but the mutant could still invade the vascular bundles of banana roots. The results lay a foundation for studying the roles of G-protein in Foc.

Key words Fusarium oxysporum f. sp. cubense；G-protein；Pathogenicity；Growth；Development

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.018

尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. cubense）可從香蕉根系侵入并造成維管束萎蔫和植株枯萎，是制約香蕉生產的重要病原菌之一。同時，尖孢鐮刀菌古巴?；涂稍谕寥乐写婊疃嗄?，化學藥劑難以有效防治，選用抗病香蕉品種是防治香蕉枯萎病的有效措施[1]。抗病香蕉品種的選育依賴于對香蕉與枯萎病菌的相互作用機制以及病原菌致病機理的深入理解。

目前有關尖孢鐮刀菌致病機理的研究已取得相當進展。許多重要致病基因已被鑒定，包括fmk1、ste12、chs2、chs7、chsV、rho1、fow1、fow2、six1和 frp1等基因[2-3]，這為進一步揭示尖孢鐮刀菌致病信號網絡奠定了基礎。近年來，尖孢鐮刀菌古巴?；椭虏』虻难芯恳踩〉昧艘恍┲匾M展。相關學者通過構建尖孢鐮刀菌T-DNA插入突變體庫，鑒定了一些致病力減弱或喪失的突變體，并進一步鑒定了T-DNA所插入的基因序列[4-7]。Qi等[8]通過基因敲除策略鑒定了轉錄因子編碼基因foatf1等重要致病基因。

G蛋白在真菌生長、發育和致病力等方面具有重要的調控作用[9]。部分學者研究發現尖孢鐮刀菌G蛋白具有相似的功能。Jain等[10-11]首先通過基因破壞策略研究了尖孢鐮刀菌黃瓜?；停‵. oxysporum f. sp. cucumerinum）G蛋白α和β亞基編碼基因fga1、fga2、fgb1的功能，結果發現fga1和fgb1基因失活突變體對黃瓜的致病力減弱，其菌落形態、產孢量、孢子萌發率和耐熱性等發生顯著變化。fga2基因失活突變體對黃瓜的致病性完全喪失，但是菌落形態和產孢量并沒有發生明顯改變[12]。Delgado-Jarana等[13]研究結果發現，G蛋白β亞基FGB1可通過依賴環化腺苷酸（cAMP）的途徑或不依賴cAMP的信號途徑調控菌絲的生長、發育和致病性。盡管關于這些G蛋白編碼基因的功能在尖孢鐮刀菌黃瓜?；椭幸延兴U明，但與其在尖孢鐮刀菌古巴專化型中的功能是否一致仍有待驗證。

因此筆者通過DNA重組策略敲除古巴專化型菌株fgb1基因，以驗證G蛋白β亞基編碼基因在尖孢鐮刀菌古巴?；途曛械墓δ堋?/p>

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基 PDA培養基（馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L）；PDB成分與PDA相同，但不加瓊脂；再生培養基（馬鈴薯200 g/L、蔗糖174 g/L、瓊脂20 g/L）。

1.1.2 試劑 轉化使用的溶液為STC溶液[1.2 mol/L山梨醇、 0.5%氯化鈣、 100 mmol/L Tris-HCL（pH7.0）、 25 mmol/L EDTA]； PTC溶液[STC溶液、 10%（W/V）PEG4000]； 0.7 mol/L氯化鈉溶液；Driselase崩潰酶溶液（20 mg/mL， Sigma）；溶壁酶Lysing Enzyme（廣州微生物研究所）。

1.1.3 供試菌株和質粒 尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. cubense）4號小種菌株B2分離自感病的巴西蕉；pCT74質粒由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所微生物資源研究利用課題組保存。

1.1.4 供試香蕉品種 巴西蕉（Musa sp. AAA）試管苗由中國熱帶農業科學院組織培養中心提供。試管苗經清水洗凈后種于砂土中，栽培1個月左右。

1.2 方法

1.2.1 真菌基因組DNA提取 將B2菌株接種于PDB培養基，以150 r/min、28 ℃搖床震蕩培養5 d，過濾收集菌絲體，瀝干后用于基因組DNA提取。 DNA提取采用CTAB法[14-15]。

1.2.2 fgb1基因敲除載體的構建 以基因組DNA為模板，用引物對AF（5′-ggggtaccGACGGTTACGAT

TGAGTGA-3′，小寫字母線堿基為KpnⅠ識別序列）和AR（5′-ccgctcgagTGAAGTTGGTGGATGGATG-3′，

小寫字母堿基為XhoⅠ識別序列）進行PCR擴增，獲得fgb1基因開放閱讀框上游5′端同源臂DNA；用引物對BF（5′-cggaattcCGGCGACTATACCATCTG

-3′，小寫字母堿基為EcoRⅠ識別序列）和BR（5′-tgctctagaGACATCAAGAGCGATACCA-3′，小寫字母堿基為XbaⅠ識別序列）進行PCR擴增，獲得下游3′端同源臂DNA。PCR擴增采用Premix TaqTM試劑（TaKaRa，Dalian），擴增條件為：95 ℃預變性5 min，然后進行35個擴增循環（95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min），最后72 ℃保溫5 min。將所擴增的DNA片段分別連接于pMD19T載體，形成pMD19T-5A和pMD19T-3B克隆載體。再用限制性內切酶KpnⅠ和XhoⅠ、EcoRⅠ和 XbaⅠ從克隆載體上切下5′端和3′端同源臂DNA，將其分別連接于經相同限制性內切酶酶切的線性pCT74載體（包含潮霉素抗性基因hph和gfp基因表達盒）中，構建成pCT74-fgb1載體。最后用KpnⅠ和XbaⅠ從pCT74-fgb1載體中切下用于轉化的DNA片斷，經回收純化后備用。

1.2.3 尖孢鐮刀菌原生質體制備和DNA轉化 參照謝德嘯等[16]報道的方法。

1.2.4 fgb1基因敲除突變體的鑒定 采用CTAB法提取轉化子基因組DNA，經紫外分光光度計檢測合格后，將其作為PCR擴增的模板。分別以轉化子和野生型菌株B2基因組DNA為模板，采用引物F1（5′-AGGTCGGATTGGATGGAGTG-3′）和F2（5′-CGTTGCAAGACCTGCCTGAA-3′）進PCR擴增，檢測轉化子是否在fgb1基因開放閱讀框5′端發生同源重組；用引物C1（5′-ATGAACTCGCAAGG

CAACAG-3′）和C2（5′-TCATTTTCCTCTCGGTGTAC

CG-3′）進行PCR擴增，檢測轉化子是否存在fgb1基因開放閱讀框，預計分別擴增約1 663 bp和1 380 bp的 DNA片段。如果用F1和F2引物進行PCR擴增結果為陽性，而用C1和C2 引物進行PCR擴增結果為陰性，那么這類轉化子即為fgb1基因敲除突變體。PCR擴增采用Premix TaqTM試劑（TaKaRa，Dalian），擴增條件為：95 ℃預變性5 min，然后進行35個擴增循環（95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min），最后72 ℃保溫5 min。

1.2.5 突變體菌落形態觀察 用體式顯微鏡（SZX7，Olympus）放大10倍觀察單菌落形態并拍照。

1.2.6 孢子懸浮液配制 將fgb1基因敲除突變體和野生型菌株B2分別接種于200 mL的PDB培養基中，置于25 ℃、180 r/min的搖床中震蕩培養7 d。離心收集菌體，用蒸餾水重懸，將分生孢子懸浮液濃度調至106個/mL。

1.2.7 致病性測定及病情統計 將香蕉苗用清水洗凈根部沙土后，各取約30株幼苗，將其根系分別浸于fgb1敲除突變體和野生型菌株B2孢子懸浮液中，放置5 min后取出，重新種于土中，以無菌水浸泡5 min作為對照。經處理后按照常規方法栽培管理，并觀察植株的發病情況。3周后調查病害發生情況，從球莖中間縱向切開，觀察球莖褐變程度以及葉片黃化情況，記錄每株幼苗發病級數，病害分級參考郭立佳等[14]的方法。

1.2.8 激光共聚焦顯微觀察 取感病的香蕉根系進行徒手切片，臨時制片，置于激光共聚焦顯微鏡（FV1000，Olympus）下，用波長為488 nm的光線激發，具體參照Hamm等[17]所述方法進行。

1.3 數據統計分析

接種fgb1基因突變體和野生型菌株B2的香蕉幼苗發病情況用病情指數表示，病情指數計算采用此公式：病情指數=100×[∑（植株發病級數×對應株數）/（植株發病最高級數×總株數）]。數據采用SigmaPlot 12.5軟件統計分析模塊進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 fgb1基因敲除載體構建

用4種限制性內切酶對所構建的質粒pCT74-fgb1進行酶切分析。結果表明（圖1），用KpnⅠ和 XhoⅠ酶切可從載體上切下預計約600 bp的DNA條帶；用 EcoRⅠ和XbaⅠ酶切，也可切下約800 bp的DNA條帶。測序結果表明所克隆的DNA序列正確，說明fgb1基因敲除載體已構建成功。

2.2 PCR鑒定fgb1敲除突變體

經再生培養和潮霉素抗性篩選，獲得一批轉化子，挑選其中的6個轉化子，提取基因組DNA，以其為模板，用C1/C2引物對進行PCR擴增，結果顯示轉化子D1～D3和清水對照無擴增條帶，D4～D6和野生型菌株B2均有1.4 kb左右的DNA擴增條帶；用F1/F2引物對進行PCR擴增，結果顯示，以轉化子D1～D4基因組DNA為模板，可擴增到約1.6 kb的DNA條帶，其余模板及清水對照均無PCR擴增條帶（圖2）。結果表明D1～D3轉化子均為fgb1基因敲除突變體，分別命名為Δfgb1-1、Δfgb1-2、Δfgb1-3。

2.3 fgb1基因敲除突變體表型分析

fgb1基因敲除突變體菌株Δfgb1-1和Δfgb1-2與野生型菌株B2在PDA平板上形成的菌落形態相似（圖3-A）；在PDA平板上劃線培養36 h，野生型菌株B2的菌絲呈輻射狀向四周生長，與之不同，突變體菌株Δfgb1-1的菌絲呈直線沿兩端生長，菌絲分枝明顯減少（圖3-B）。將野生型菌株B2與fgb1敲除突變體菌株Δfgb1-1和Δfgb1-2分別接種于PDA平板上并培養4 d，測量其菌落直徑，結果表明野生型菌落平均直徑（4.88 cm）極顯著（t測驗，p<0.01）大于突變體菌株Δfgb1-1（4.30 cm）和Δfgb1-2（4.32 cm）菌落平均直徑（圖3-C）。在PDA平板上培養7 d，Δfgb1-1和Δfgb1-2突變體菌株單菌落產孢量（1.1×109和1.3×109，圖3-D）低于野生型菌株B2（2.3×109）?？梢?，fgb1基因的敲除導致突變體菌株菌絲分枝減少，菌落生長減慢，產孢量減少。

2.4 fgb1敲除突變體對巴西蕉的致病性

統計接種野生型菌株B2與fgb1敲除突變體菌株Δfgb1-1和Δfgb1-2的巴西蕉病情指數。發現接種fgb1敲除突變體菌株Δfgb1-1和Δfgb1-2的巴西蕉幼苗平均病情指數（15.3和17.8，圖4）均顯著（t測驗，p<0.01）低于野生型菌株B2（63.7，圖4）。結果表明fgb1敲除突變體對巴西蕉的致病性顯著降低。

2.5 fgb1敲除突變體在巴西蕉根系中的侵染情況 用共聚焦激光顯微鏡觀察fgb1基因敲除突變體菌株在根系中的定殖，結果發現其既可在根系皮層定殖（圖5-A），也可侵入根系維管束，在木質部定殖（圖5-B）。結果表明fgb1基因敲除突變體雖然致病力減弱，但其仍可侵染巴西蕉根系，并在維管束定殖。

3 討論與結論

在真核生物中，G蛋白在細胞的生長發育等生物學過程中具有重要作用。由G蛋白α、β和γ亞基組成的異源三聚體在結合GDP時無活性，由受體催化的鳥嘌呤核苷酸交換使GTP結合到α亞基上，導致α亞基的活化，并與β和γ亞基解離，隨后游離的Gα亞基和Gβγ異二聚體激活下游的效應物。當GTP水解為GDP時，α亞基失活，細胞響應完成[17]。不同真菌的G蛋白氨基酸序列之間具有較高的相似性，其中β亞基氨基酸序列中包含2個保守基序即IYAMHW和GHDNRV[10]，因此其在功能上也具有相當的保守性。尖孢鐮刀菌不同專化型菌株的G蛋白β亞基的氨基酸序列之間也具有很高的相似性，Jain等[10]和Delgado-Jarana等[13]研究發現尖孢鐮刀菌黃瓜專化型和番茄?；偷腉蛋白β亞基具有一致的功能，即調控菌絲生長、發育和致病性，筆者發現G蛋白β亞基在尖孢鐮刀菌古巴專化型中也具有基本相同的功能，包括調控菌絲生長、菌絲分枝和產孢量以及致病性。它們的差別如下：在尖孢鐮刀菌古巴?；椭?，敲除fgb1導致菌絲生長減緩（圖3），而在尖孢鐮刀菌黃瓜?；秃头褜；椭?，敲除fgb1則促進菌絲生長[10，13]。

盡管關于fgb1基因在尖孢鐮刀菌黃瓜?；秃头褜；途曛械墓δ芤延兴U明，但fgb1敲除突變體是否能侵入根系維管束仍是未知。筆者采用gfp和潮霉素抗性hph基因，通過DNA同源重組替換fgb1基因（圖2），所得的fgb1基因敲除突變體攜帶gfp基因，因此可用熒光顯微鏡觀察突變體在香蕉植株中的侵染和定殖情況。通過用激光共聚焦顯微鏡觀察fgb1突變體在巴西蕉根系中的定殖，筆者發現其可穿透根系皮層和進入維管束木質部，并在其中定殖（圖5）。這與以GFP標記的野生型菌株在巴西蕉根系中的侵染定殖方式相似[18]。與此不同，Inoue等[19]研究發現，破壞Fow1基因導致突變體菌株對西甜瓜的致病性顯著降低，突變體菌株只能穿透西甜瓜根系表皮，而不能侵入維管束。Kim等[20]發現，破壞尖孢鐮刀菌蛋白激酶A編碼基因FoCPKA導致突變體菌株不能侵入擬南芥根系維管束。因此，可推測G蛋白β亞基FGB1調控尖孢鐮刀菌的致病性可能是通過采用不同于Fow1和FoCPKA的信號途徑。此外，與野生型菌株相比，fgb1基因突變體致病力雖然顯著減弱，但是其仍然能侵入香蕉根系木質部維管束，筆者推測這可能是由于fgb1基因敲除突變體在侵染香蕉根系的過程中受到宿主的防御，其侵染性生長受一定程度的限制，但仍然能以較慢的速度侵入木質部維管束，其具體機制仍有待進一步研究。

筆者通過構建fgb1基因敲除突變體，分析突變體表型，發現FGB1可調控尖孢鐮刀菌古巴專化型菌絲的生長、發育和致病性，其調控尖孢鐮刀菌古巴專化型的致病性可能是通過采用不同于Fow1 和蛋白激酶A（FoCPKA）的信號途徑。本研究結果為進一步研究G蛋白信號傳導途徑在尖孢鐮刀菌古巴?；椭虏∵^程中的作用奠定了基礎。

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