檳榔植原體膜蛋白基因的克隆及其抗血清制備

楊文君等

摘 要 根據實驗室測得的檳榔植原體膜蛋白基因（AcPmp）序列設計1對特異引物mp-FP/mp-RP，以病樣檳榔總DNA為模板擴增該AcPmp的編碼區并連接到pMD19T simple中間載體。將測序正確的陽性菌提取質粒pMD19T-AcPmp，經NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收AcPmp片段，然后以正確的編碼框連接到原核表達載體pET32a（+），轉化Escherichia coli BL21感受態細胞。含有pET32a-AcPmp的BL21表達菌經IPTG誘導和SDS-PAGE分析表明，在30 ℃，0.1 mmol/L IPTG條件下誘導4 h，可產生部分可溶性的融合蛋白。利用Ni2+-NTA親和層析柱法進行純化并獲得高純度的可溶性融合蛋白。將純化后的融合蛋白多次免疫家兔，取其抗血清，以融合蛋白（1 ∶ 10 000稀釋）作抗原，間接ELISA法測定抗血清效價大于125 000。Western Blot雜交結果表明檳榔植原體膜蛋白抗血清能與融合蛋白特異性結合。

關鍵詞 檳榔植原體；膜蛋白基因；原核表達；抗血清制備

中圖分類號 S59 文獻標識碼 A

Abstract Total DNA was extracted from the infected Areca and used for amplifying the membrane protein gene of Areca Phytoplasma by using primers mp-FP/mp-RP based on its sequence from previous study. The membrane protein gene was finally inserted into prokaryotic expression vector pET-32a（+）and the recombinant plasmid pET32a-AcPmp was identified by NcoⅠ/XhoⅠ restriction enzymes and Sanger sequencing. Subsequently the recombinant plasmid was transferred into Escherichia coli BL21 competent cell， and the positive colony was induced at 30 ℃ with 0.1 mmol/L IPTG for 4 hours. The result showed that small part of soluble fused protein was expressed and then purified by Ni2+-NTA agarose affinity chromatography， and the high purity of fused protein was finally obtained in 500 mmol/L imidazole Elution buffer. Two rabbits were immunizeed for 3 times by using purified protein and phosphate buffer control the antiserum against Phytoplasma MP was collected and indirect. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay（ID-ELISA）indicated that the titer of antiserum was higher than 1 ∶ 125 000. Western Blot analysis further showed that the antiserum was specifically binding with the MP fused protein.

Key words Areca phytoplasma； Membrane protein gene； Prokaryotic expression； Preparing anti-serum

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.024

檳榔（Areca catechu Linnaeus）屬棕櫚科檳榔屬（Areca）多年生常綠喬木，是一種典型的熱帶經濟作物和觀賞作物，也是重要的南藥資源之一。據報道，在中國海南省，檳榔是第二大經濟作物。而檳榔黃化病是檳榔上主要的病害之一，現已遍及印度、中國等大部分檳榔生產國主產區，造成檳榔大面積減產，并且有進一步擴大的趨勢。1976年后，國內外科研工作者通過各種方法證實了在發病的檳榔中存在植原體[1-7]，但是植原體是否為檳榔黃化病的真正病原還在進一步研究當中。

植原體（Phyltoplasm）原稱類菌原體（mycoplasma like-organism，MLO），是一類無細胞壁的植物病原微生物，其基因組較小（約0.53～1.35 Mb）[8-9]，（G+C）含量較低（約25 mol），在系統分類學上植原體屬于柔膜體綱（Mollicutes）[10]。就物種起源而言，植原體被認為是厭氧植原體屬中形成的一個單元演化分枝；從進化學說而論，植原體來自于革蘭氏陽性菌，梭菌屬細菌的祖先[11]。植原體不能人工培養，主要寄生于植物韌皮部篩管細胞中，可引起植物植株黃化、叢枝、花變葉、矮縮或花器返祖等癥狀，給經濟作物造成巨大的損失[12]。自1967年由Doi首次報道植原體以來，至今已發現有300多種植物的病害與植原體相關，其中在中國已報道的約74種[13-15]。由于植原體沒有細胞壁，菌體細胞膜直接與寄主植物或蟲媒介體細胞接觸，因此，認為其膜蛋白可能在蟲媒介體-植原體-寄主植物的相互關系中起著非常重要的作用[16-21]。

本研究PCR擴增獲得海南瓊海檳榔植原體膜蛋白基因（AcPmp）編碼區序列，構建到原核表達載體pET32a（+）并轉化表達菌。通過該融合蛋白的表達、Ni2+-NTA親和層析柱法純化以及家兔免疫，制備了效價高、特異性強的檳榔植原體膜蛋白抗血清，為后期著手開展植原體膜蛋白與寄主蛋白之間的互作等研究奠定了前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病樣 檳榔黃化病病樣材料采至海南瓊海，16S rRNA檢測為陽性。健康檳榔由本實驗室保存提供。

1.1.2 菌株與質粒 克隆載體pMD19T simple vector購至大連寶生物公司（TaKaRa）；表達載體pET-32a（+）由本實驗室保存；克隆菌株E.coli DH5α購至北京全式金生物技術有限公司；表達菌株E.coli BL21（DE3）購至德國默克公司。

1.1.3 酶和化學試劑 PrimerSTARTM HS DNA polymerase、rTaq DNA polymerase、氨芐青霉素（Ampicillin）、IPTG均購自大連寶生物公司；限制性內切酶NcoⅠ/XhoⅠ購自Fermentas公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA Marker購自天根生化科技有限公司；蛋白低分子量Marker購自Promega公司；丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）購自Solarbio公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）、考馬斯亮藍R-250購自Amresco公司；其它化學試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 檳榔基因組總DNA提取按照本實驗室改良的CTAB法[22]。

1.2.2 PCR產物的克隆及測序 根據實驗室測得的檳榔植原體膜蛋白基因編碼區序列（圖1）設計一對特異引物mp-FP（5′-TGCCATGGCTATGAATCAC

AAAGAAAATTTTTTA-3′，含NcoⅠ酶切位點）和mp-RP（5′-CCCTCGAGTTATGATTGTACTTTTAAGT

CTGT-3′，含XhoⅠ酶切位點）。引物由Invitrogen公司合成。

PCR反應條件如下：94 ℃預變性3 min ；94 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s ，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min并終止。取適量PCR產物進行瓊脂糖凝膠（1%）電泳檢測，剩余PCR產物采用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生物技術有限公司）回收純化，具體操作過程參照說明書進行。將純化PCR產物用T-A克隆的方法連接到質粒pMD19T simple vector（TaKaRa公司），轉化DH5α大腸桿菌。經菌液PCR和質粒雙酶切（NcoⅠ/XhoⅠ）鑒定后，陽性克隆子送往上海英俊生物技術有限公司進行測序。

1.2.3 原核表達載體的構建及鑒定 將中間質粒pMD19T-AcPmp和表達載體pET32a（+）分別進行NcoⅠ/XhoⅠ雙酶切，37 ℃水浴過夜。TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化線性的AcPmp和pET32a（+）片段。將回收的目的基因AcPmp片段連接到pET32a（+）上，構建重組表達質粒pET32a-AcPmp。連接產物轉化到BL21（DE3）大腸桿菌感受態細胞。經菌液PCR和NcoⅠ/XhoⅠ質粒雙酶切鑒定后，再隨機選擇3個陽性單克隆送往上海英俊生物技術有限公司進行測序。

1.2.4 融合蛋白的誘導表達和可溶性分析 含有重組質粒pET32a-AcPmp的大腸桿菌（BL 21）以1 ∶ 100的接種量接種于50 mL LB液體培養基（含氨芐青霉素100 μg/mL）中，37 ℃搖床振蕩培養。A600值達到0.5～0.6時，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，30 ℃繼續誘導培養3～6 h。

取不同誘導時間的表達菌液1 mL加入2 mL離心管中，12 000 r/min離心1 min，棄上清，沉淀用50 μL雙蒸水懸浮，再加入50 μL的2×SDS-PAGE上樣緩沖液混勻，沸水浴煮5 min后放置在冰上2 min。在4 ℃條件下，12 000 r/min離心1 min，取上清10 μL進行SDS-PAGE電泳。另收集經誘導培養4 h的菌液10 mL，離心沉淀后用500 μL雙蒸水懸浮細胞，使用超聲波進行菌體破碎；離心后將上清轉到2 mL離心管中，沉淀用500 μL雙蒸水重懸。取5 μL上清和5 μL沉淀，加入等體積2×SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴煮5 min。取10 μL進行SDS-PAGE電泳，分析融合蛋白的可溶性。

1.2.5 融合蛋白的純化 擴大培養pET32a-AcPmp表達菌至1 L，按上述條件誘導表達4 h。于4 ℃ 6 000 r/min離心30 min，菌體沉淀溶于50 mL Binding buffer中，冰浴放置30 min。冰上超聲波破碎儀破碎細胞后，于4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，上清過0.45 μm濾膜。過膜上清液進行Ni2+-NTA親和層析柱純化：用6 mL滅菌水洗滌瓊脂糖樹脂2次，再用6 mL Binding Buffer平衡親和柱；然后含目的蛋白的上清液上柱，用6 mL Washing Buffer（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）洗脫雜蛋白；最后再以6 mL Elution Buffer（500 mmol/L NaCl，0.5 mol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）將融合蛋白洗脫下來。融合蛋白溶液置換：將含有融合蛋白的Elution Buffer置于透析袋經100 mL 1×PBS溶液透析3次，即可獲得溶于PBS的純化蛋白。

1.2.6 抗血清制備及血清學檢測 純化的融合蛋白溶液經透析袋透析后獲得溶于1×PBS的蛋白溶液，利用BCA法測定其濃度后，與佐劑（1 ∶ 1）混勻，采用皮下多點注射抗原的方法多次免疫家兔，每只家兔的融合蛋白總注射量為1.5～2.0 mg。第3次免疫10 d后，每只白兔耳緣靜脈取血0.5～1.0 mL，分離抗血清。以1×PBS的蛋白溶液（1 ∶ 10 000）作抗原，ID-ELISA法檢測抗血清效價，血清效價未符合要求則繼續免疫。血清效價符合要求后，心臟采血，分離抗血清。以免疫前的家兔血清為對照。

1.2.7 Western Blot鑒定抗血清特異性 取誘導表達4 h的pET32a-AcPmp菌體，處理后進行SDS-PAGE凝膠電泳。用蒸餾水漂洗電泳后的蛋白膠，轉入電轉液中平衡10 min。利用轉膜儀在100 V，60 mA的條件下反應1 h使蛋白轉移到NC膜上，取出NC膜并在蒸餾水中漂洗。將NC膜平衡于TBST緩沖液[20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），150 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20]后，置于含有5%脫脂牛奶的封閉液中封閉過夜（4 ℃）。然后用TBST緩沖液漂洗NC膜3次，將其放入按1 ∶ 5 000的一抗TBST溶液，在37 ℃孵育40 min。取出NC膜經TBST漂洗后，轉入按1 ∶ 30 000稀釋的堿性磷酸標記的山羊抗兔（IgG）TBST溶液中，37 ℃孵育40 min。再取出NC膜，經TBST漂洗后，滴加含有330 μg/mL NBT（0.5 g NBT溶于10 mL 70%的二甲基甲酰胺）和165 μg/m LBCIP（0.5 g BCIP溶于10 mL 100%的二甲基甲酰胺）的顯色液于NC膜蛋白面，直到條帶清晰后，用蒸餾水漂洗2次，終止顯色反應。取出NC膜晾干并掃描保存圖片。

2 結果與分析

2.1 AcPmp基因克隆和表達質粒的構建

從病樣總DNA中擴增獲得的AcPmp基因片段，經1%瓊脂糖凝膠電泳后結果如圖所示（圖2），擴增片段大小約為500 bp，與預期結果相符，而健康植株和ddH2O對照均未出現特異性擴增條帶。

構建的表達質粒pET32a-AcPmp經XhoⅠ/NcoⅠ雙酶切驗證，出現特異性DNA條帶，其中一條大小約為500 bp（圖3），與預期AcPmp基因片段結果相符。測序結果進一步證明成功構建了重組表達質粒pET32a-AcPmp。

2.2 融合蛋白的誘導表達及可溶性分析

SDS-PAGE電泳結果顯示（如圖4）：含有pET32a-AcPmp重組質粒的表達菌經IPTG誘導表達4、6 h后，在大小約37 ku處均有一明顯的蛋白條帶，其大小與預估的融合蛋白（6×His-AcPmp）符合。而未誘導的BL21表達菌、pET32a/BL21表達菌、pET32a-AcPmp/BL21表達菌和IPTG誘導的BL21表達菌、pET32a/BL21表達菌均未出現該特異蛋白條帶。

融合蛋白的可溶性分析（如圖5）：SDS-PAGE膠顯示融合蛋白（6×His-AcPmp）主要以沉淀的形式表達，但是仍有一小部分溶于溶液中，即可溶性融合蛋白，含量較低。

2.3 融合蛋白的純化

為了簡便操作過程和盡量保持融合蛋白的生物活性，筆者選擇上清液（可溶性的融合蛋白）進行Ni2+-NTA親和層析蛋白純化。于30 ℃，IPTG終濃度為0.1 mmol/L的條件下，對重組表達菌pET32a-AcPmp/BL21進行大量（1 L）誘導培養4 h。如2.2所述，獲得的融合蛋白大部分以包涵體形式存在，但也有一小部分可溶于溶液中，即是可溶性的。可溶性的雜蛋白經100 mmol/L咪唑濃度的washing buffer洗脫除去后，與親和層析柱Ni2+螯合的目的蛋白純度已達要求。最終，用含500 mmol/L咪唑濃度的washing buffer將融合蛋白溶于其中（圖6）。

2.4 抗血清制備和效價測定

用ID-ELISA法對家兔進行免疫前血清本底水平檢測，結果顯示：實驗所選用的新西蘭大白兔（編號A）血清本底比較低（表1），符合實驗要求。將溶于1×PBS溶液的純化融合蛋白作為免疫原，第一次與完全佐劑等比例混勻，第二、三次與不完全佐劑等比例混勻，采用肌肉與皮下注射相結合免疫新西蘭大白兔。3次注射后采集血清，以融合蛋白溶液（1 ∶ 10 000稀釋）為抗原進行ID-ELISA測定抗血清效價。結果顯示（表2），本試驗制備的多克隆抗血清的效價大于125 000。

2.5 Western Blot鑒定抗血清特異性

經Western Blot抗原抗體結合反應和NBT/BCIP顯色反應，兔抗融合蛋白（6×His-AcPmp）的抗血清與IPTG誘導的pET32a-AcPmp表達菌有特異性反應（圖7），其特異性蛋白大小約為37 ku，與預期大小相符，而與其它雜蛋白條帶均無明顯特異反應，表明本研究制備的兔抗融合蛋白抗血清具有較好的特異性。

3 討論與結論

隨著生物技術，特別是蛋白分子生物學的快速發展，研究學者們對蛋白的結構及生物學功能的認識有了顯著的提高。從蛋白的溶解度方面來說，目前常規純化技術對于可溶性蛋白的分析、純化和制備均具有較高的成功率。但對于一些棘手的不溶性蛋白質（如膜蛋白等）的純化研究卻困難重重，如蛋白質的活性問題等。近年來，對于膜蛋白質的純化和功能研究等技術是非常迫切的，這是因為膜蛋白在基礎生理過程中（如信號轉導、分子轉運、能量利用以及細胞和組織結構的維護）具有極其重要的作用。

利用細菌原核表達系統表達外源蛋白來獲得高純度和高濃度的蛋白已經成為一項成熟的實驗技術，且可選擇的宿主和載體具有多樣性，這就為不同性質的蛋白表達和蛋白純化奠定了基礎。表達的外源蛋白主要有2種形式，一種是可溶性的外源融合蛋白，一種是以包涵體形式存在的融合蛋白。這2種不同形式的蛋白進行純化時，主要區別在于包涵體需要經過變復性處理，而可溶性蛋白則不需要[23]。本研究的檳榔植原體膜蛋白在大腸桿菌中主要以包涵體的形式存在，但仍有一小部分是可溶的。為了簡便操作過程和盡量保持融合蛋白的生物活性，我們選擇上清液（可溶性的融合蛋白）進行Ni2+-NTA親和層析蛋白純化。在30 ℃的條件下大量誘導表達融合蛋白，取可溶性的上清（含部分融合蛋白）進行純化，與佐劑混勻多次免疫新西蘭大白兔，制備高特異高效價的抗血清。

本研究制備的檳榔植原體膜蛋白多克隆抗血清具有效價高、特異性強等特點，且抗血清將為后續細菌雙雜交或酵母雙雜交等實驗的展開奠定基礎。除此之外，現今檳榔植原體的檢測或診斷基本采用PCR方法[24-25]，而其它的快速檢測方法較欠缺。與PCR方法相比[24-25]，本研究檳榔植原體膜蛋白多克隆抗血清的制備，是后續ELISA檢測方法建立的先決條件，將大大降低檢測檳榔植原體的費用，具有操作簡單、快速、應用范圍廣泛等特點[26]。

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