三倍體枇杷莖尖培養(yǎng)與植株再生

陶煉等

摘 要 以三倍體枇杷莖尖為外植體，研究了取材時間及莖尖大小、植物生長調(diào)節(jié)劑對三倍體枇杷莖尖培養(yǎng)與植株再生過程中萌發(fā)、伸長、生根及移栽的影響。結(jié)果表明：春季取材且莖尖大小為0.7 cm時，莖尖成活率最高，為77.5%；初代培養(yǎng)適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.5 mg/L，在此培養(yǎng)基上，三倍體枇杷莖尖萌發(fā)率高達(dá)91%；莖尖伸長適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+GA3 0.3 mg/L，平均芽苗高度可達(dá)4.9 cm；芽苗增殖適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+Tryptone 750 mg/L，增殖系數(shù)為7.7；生根適宜培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.25 mg/L+IBA 2.0 mg/L，生根率為73.3%；三倍體枇杷組培苗移栽入腐熟有機(jī)肥 ∶ 園土 ∶ 鋸末（1 ∶ 2 ∶ 1）的基質(zhì)中成活率達(dá)到93.67%。

關(guān)鍵詞 三倍體枇杷；莖尖培養(yǎng)；植株再生

中圖分類號 S667.304 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Plant regeneration was completed for the first time using shoot tips as the explants harvested from a triploid mother plant in loquat. A series of experiments were carried out to investigate the effects of sampling time and the size of the explants，growth regulators on shoot tip sprouting，elongation，rooting and transplantation. The results showed that sampling in spring and shoot-tip size of 0.7 cm were appropriate，resulting in a survival rate of 77.5%. Appropriate initial culture medium was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L，in which the sprouting rate reached 91%. Suitable medium for shoot elongation was MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+GA3 0.3 mg/L，which resulted in an average shoot height of 4.9 cm. The most suitable medium for shoot proliferation was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+Tryptone 750 mg/L，in which a high multiplication coefficient of 7.7 was obtained. The most suitable medium for rooting was 1/2MS+NAA 0.25 mg/L+IBA 2.0 mg/L，in which the rooting rate was 73.3%. The rooted plantlets，after hardening，survived at a rate of 93.67% in the transplantation matrix of decomposed organic fertilizers，garden soil and sawdust（1 ∶ 2 ∶ 1）under careful temperature and water management.

Key words Triploid loquat； Shoot tip culture； Plant regeneration

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.025

枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）系薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae）枇杷屬（Eriobotrya）植物，原產(chǎn)中國西南（四川雅安市境內(nèi)大渡河流域），已有2100多年的栽培歷史[1]，中國是世界枇杷的自然分布中心和栽培中心[2]。

枇杷果實中種子的重量約占果重的1/3，可食率不高，嚴(yán)重影響了枇杷的食用價值與商品價值[3]。因此，國內(nèi)外科研人員長期致力于提高果實可食率的枇杷品種改良和新品種選育工作，其中重要途徑之一就是通過創(chuàng)制枇杷三倍體材料來培育無籽品種。至今，全世界創(chuàng)制出三倍體枇杷材料且尚有種質(zhì)保存的僅有西南大學(xué)的梁國魯和四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的王永清，梁國魯?shù)牟呗允菑拇罅糠N子實生苗海選獲得天然枇杷三倍體[4]，王永清則另辟蹊徑，從控制授粉獲得的枇杷小種子植株中，獲得了高頻率的枇杷三倍體[5]。然而，三倍體枇杷因染色體組的原因表現(xiàn)出育性較低，在不施用生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的情況下坐果率較低，果實較小，商品性較差[6]，而利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對三倍體枇杷進(jìn)行遺傳改良，減少其對外源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的依賴，提高其坐果率，改善果實商品性則具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

近年來，利用莖尖分生組織再生體系作為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化在多種植物上已成功應(yīng)用[7-10]。在枇杷上，二倍體材料莖尖培養(yǎng)和植株再生研究已取得一定進(jìn)展[11-12]，三倍體枇杷莖尖培養(yǎng)由于莖尖茸毛多，酚類物質(zhì)含量高等問題，再生難度大，至今未見任何報道。因此，本研究以四川農(nóng)業(yè)大學(xué)自主創(chuàng)制的三倍體枇杷為材料，旨在建立三倍體枇杷莖尖培養(yǎng)和植株再生體系，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對三倍體枇杷進(jìn)行遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以四川農(nóng)業(yè)大學(xué)自主創(chuàng)制的三倍體枇杷（2n=3x=51）為材料（圖版Ⅰ-A），取其莖尖為外植體。

1.2 方法

1.2.1 初代培養(yǎng) 最佳取材時間及莖尖大小的篩選：分別選取春、夏、秋、冬梢莖尖為外植體，用75%酒精處理20 s，0.1%升汞處理8 min，無菌水沖洗多次后，將莖尖分為3個大?。?.4、0.7、1.0 cm），接種于MS基本培養(yǎng)基中，采用兩因素完全實驗設(shè)計，每組處理接種60個外植體，重復(fù)3次，14 d后統(tǒng)計褐化率（褐化的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%）、污染率（污染的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%）、成活率（成活的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%），找出最佳的取材時期和莖尖大小。

初代培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑的篩選：采用篩選出的外植體取材時期和莖尖大小，以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA（1.0、2.0、3.0）mg/L、NAA（0.1、0.25、0.5）mg/L和IBA（0.5、1.0、1.5）mg/L，采用三因素三水平正交實驗設(shè)計，培養(yǎng)基中均附加瓊脂7.5 g/L、蔗糖30 g/L，pH5.8，每處理接種60個外植體，重復(fù)3次。接種后定期觀察莖尖生長狀況，30 d后統(tǒng)計萌發(fā)率（萌發(fā)的外植體數(shù)/成活的外植體數(shù)×100%）及平均芽苗高度。

1.2.2 芽苗伸長培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)獲得的芽苗轉(zhuǎn)移到伸長培養(yǎng)基上，伸長培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA（0.5、1.0、1.5）mg/L，NAA（0.1、0.2、0.3）mg/L，GA3（0.1、0.2、0.3）mg/L，采用三因素三水平正交實驗設(shè)計，培養(yǎng)基中均附加瓊脂7.5 g/L、蔗糖30 g/L，pH5.8，每處理接種60個外植體，重復(fù)3次，接種后定期觀察芽苗生長狀況，30 d后統(tǒng)計芽苗高度及長勢。

1.2.3 芽苗增殖培養(yǎng) 將長1.0 cm左右的芽苗接種于增殖培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA（0.5、1.0、1.5）mg/L、NAA（0.1、0.3、0.5）mg/L和胰蛋白胨（250、500、750）mg/L，采用三因素三水平正交試驗設(shè)計，培養(yǎng)基中均附加瓊脂7.5 g/L、蔗糖30 g/L，pH5.8，每處理接種60個外植體，重復(fù)3次，接種后觀察并記錄芽苗增殖及長勢情況，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)（≧0.5 cm叢生芽數(shù)/接種芽苗數(shù)）和芽苗長勢。

1.2.4 生根培養(yǎng) 當(dāng)芽苗長至2 cm左右時，經(jīng)切割后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上，生根培養(yǎng)采用三因素三水平的正交試驗設(shè)計，基本培養(yǎng)基為（MS、1/2 MS、1/4 MS），IBA為（0、1.0、2.0）mg/L、NAA為（0、0.25、0.5）mg/L，培養(yǎng)基中同時附加瓊脂7.5 g/L、蔗糖30 g/L，pH5.8，每處理接種60個外植體，重復(fù)3次，接種10 d后開始觀察記錄生根情況，30 d時統(tǒng)計生根率（生根芽苗數(shù)/接種芽苗數(shù)×100%）、生根芽苗根數(shù)、平均根長，并觀察生根苗長勢。

1.2.5 煉苗和移栽 當(dāng)生根苗長出3～5條根時即可進(jìn)行煉苗移栽，方法是在培養(yǎng)室揭去封口膜培養(yǎng)3 d，然后取出試管苗洗去培養(yǎng)基，移栽到含有不同配比的基質(zhì)中，每種基質(zhì)移栽30株，重復(fù)3次，常規(guī)管理，30 d統(tǒng)計移栽成活率（移栽成活的組培苗數(shù)/移栽組培苗數(shù)×100%）。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照時間14 h/d，光照強(qiáng)度為30 μmol/（m2·s）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用DPS 7.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，多重比較采用Duncan新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同取材時間及莖尖大小對莖尖初代培養(yǎng)的影響

不同取材時間及莖尖大小對三倍體枇杷莖尖初代培養(yǎng)的影響見表1。從表1可以看出，冬季取材，成活率最低，為11.7%～28.9%；春季取材成活率最高，達(dá)58.9%～77.5%，為適宜的取材時間。春季取材時，當(dāng)莖尖為0.4 cm時，莖尖成活率為58.9%，污染率為10.2%，均為最低；而褐化率卻最高，為35.6%。當(dāng)莖尖為1.0 cm時，褐化率為同取材時期最低，僅為12.1%，但污染率較高，為20.2%。當(dāng)莖尖大小為0.7 cm時，既能控制較低水平的污染率（11.1%）和褐化率（12.2%），又能保證較高的成活率（77.5%），為適宜的三倍體枇杷莖尖大小。

2.2 6-BA、NAA和IBA不同濃度配比對枇杷莖尖初代培養(yǎng)的影響

6-BA、NAA及IBA的不同濃度組合對三倍體枇杷莖尖初代培養(yǎng)具有明顯的影響（表2），當(dāng)6-BA選用1.0 mg/L、NAA選用0.1 mg/L、IBA選用0.5 mg/L時，莖尖萌發(fā)率最低，僅為35.2%，極顯著地低于其他處理，芽苗高度為1.5 cm，纖細(xì)，長勢弱；當(dāng)6-BA選用1.0 mg/L、NAA選用0.5 mg/L、IBA選用1.5 mg/L時，莖尖萌發(fā)率為91%，平均芽苗高度達(dá)2 cm，且長勢好（圖版Ⅰ-B）。綜上所述，適合三倍體枇杷莖尖的初代培養(yǎng)基為：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.5 mg/L。

2.3 6-BA、NAA和GA3對三倍體枇杷芽苗伸長的影響

6-BA、NAA和GA3對三倍體枇杷芽苗伸長的影響見表3。從表3可看出，6-BA對枇杷莖尖伸長的影響很大，較低濃度的6-BA（0.5 mg/L）與不同濃度的NAA和IBA組合，莖尖芽苗高度普遍較高，在3.8～4.9 cm之間，其次是較高濃度的6-BA（1.5 mg/L）與不同濃度的NAA和IBA組合，芽苗高度普遍在3.5～4.0 cm之間，而6-BA選用中濃度1.0 mg/L時，芽苗高度普遍較低，在2.3～3.3 cm之間；當(dāng)6-BA濃度一定時，芽苗高度隨著NAA、GA3濃度的增加而升高，當(dāng)6-BA選用0.5 mg/L、NAA選用0.3 mg/L、GA3選用0.3 mg/L時，芽苗高度達(dá)到最大值，為4.9 cm，且芽苗葉顏色深綠，長勢良好（圖版Ⅰ-C）?？梢?，MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+GA3 0.3 mg/L為三倍體枇杷體莖尖伸長培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基配方。

2.4 6-BA、NAA和Tryptone對三倍體枇杷芽苗增殖的影響

6-BA、NAA與Tryptone不同濃度配比對芽苗增殖的影響見表4。經(jīng)7～10 d培養(yǎng)，芽苗的大部分腋芽開始萌動，培養(yǎng)30 d左右時已形成叢芽。6-BA濃度為1.0 mg/L，NAA濃度為0.3 mg/L，Tryptone濃度為750 mg/L的芽苗增殖系數(shù)最高，為7.7，極顯著高于其它處理，且芽苗長勢較好（圖版Ⅰ-D），其次為6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L與Tryptone 250 mg/L時，增殖系數(shù)為2.7，當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L、NAA濃度為0.5 mg/L、Tryptone濃度為750 mg/L時，增殖系數(shù)最低，僅為1.2，且芽苗基部愈傷化嚴(yán)重，長勢較弱。結(jié)合增殖系數(shù)及芽苗長勢，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+Tryptone 750 mg/L為芽苗增殖的適合培養(yǎng)基配方。

2.5 基本培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑對三倍體枇杷芽苗生根的影響

基本培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑對三倍體枇杷芽苗生根的影響見表5。從表5可以看出，基本培養(yǎng)基對三倍體枇杷芽苗生根差異明顯：以MS為基本培養(yǎng)基，未能生根，而以1/2MS、1/4MS為基本培養(yǎng)基均有不定根的發(fā)生，其中又以1/2MS為基本培養(yǎng)基的生根效果最好。植物生長調(diào)節(jié)劑對三倍體枇杷芽苗生根也有顯著的影響，培養(yǎng)基中僅添加IBA時，三倍體枇杷芽苗生根率較低，培養(yǎng)基中同時添加NAA和IBA時，芽苗生根率較高。當(dāng)以1/2MS為基本培養(yǎng)基，同時添加NAA 0.25 mg/L、IBA 2.0 mg/L時，芽苗生根率最高，達(dá)73.3%，平均根數(shù)為5.1，平均根長為4.2 cm，生根苗長勢健壯（圖版Ⅰ-E）。由此可見，1/2MS+NAA 0.25 mg/L+IBA 2.0 mg/L為三倍體枇杷莖尖培養(yǎng)適宜的生根培養(yǎng)基。

2.6 煉苗和移栽

經(jīng)煉苗移栽后的生根小植株，在不同的移栽基質(zhì)里植株成活率和植株長勢差異較大。移栽基質(zhì)配比為腐葉土 ∶ 珍珠巖=3 ∶ 1時，組培苗移栽成活率為57.27%，植株葉片小，莖桿細(xì)，長勢弱；移栽基質(zhì)配比為腐熟有機(jī)肥 ∶ 園土 ∶ 鋸末=1 ∶ 2 ∶ 1時，組培苗移栽成活率達(dá)93.67%，植株葉片大，莖桿粗壯，葉色深綠，長勢健壯（圖版Ⅰ-F）。由此可見，腐熟有機(jī)肥 ∶ 園土 ∶ 鋸末=1 ∶ 2 ∶ 1為三倍體枇杷生根組培苗移栽的適宜基質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

成年枇杷植株的葉片培養(yǎng)極其困難，外植體褐化嚴(yán)重、愈傷組織分化率低，難以滿足遺傳轉(zhuǎn)化的需要，建立新的遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)非常必要。以莖尖作為外植體不需經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)及再分化成苗階段，實驗周期短，是遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體材料，以此為受體的遺傳轉(zhuǎn)化在多種作物上得到了廣泛的應(yīng)用，包括大豆[7]、玉米[8]、棉花[9]、向日葵[10]、葡萄[13]等。

影響莖尖萌發(fā)及生長的調(diào)節(jié)物質(zhì)有BA、NAA、GA3、TDZ等，在已報道的薔薇科植物莖尖培養(yǎng)初代物建立選用最多的是BA和NAA[14-15]。而本研究結(jié)果表明：在三倍體枇杷莖尖培養(yǎng)萌發(fā)階段起著關(guān)鍵作用是IBA，在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，三倍體枇杷莖尖的萌發(fā)率隨著IBA濃度的增加而增加，這與前人的結(jié)果不一致，這表明三倍體枇杷在莖尖初代培養(yǎng)中對生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的需求與二倍體枇杷是很不一樣的。在芽苗的伸長階段，GA3起著關(guān)鍵作用，這與陳君幟等[16]的研究結(jié)果一致。

薔薇科果樹的莖尖培養(yǎng)中，很多研究結(jié)果均表明存在著生根難的問題，降低無機(jī)鹽質(zhì)量濃度配合一定濃度的生長素常常能解決生根難的問題[17]。例如，櫻桃在全量的MS培養(yǎng)基上不能生根，而在1/2MS培養(yǎng)基上可形成根或根原基，且在含有IBA的培養(yǎng)基上生根最好[18]；南果梨在MS培養(yǎng)基上只有極低的生根率，而在1/2MS+IBA生根率最高[19]；桃、杏莖尖芽苗在1/2F14+IBA或1/2MS+IBA生根率可達(dá)85%以上[17]。本研究也得到類似結(jié)果，在MS培養(yǎng)基上，三倍體枇杷芽苗不能生根，而低無機(jī)鹽濃度的基本培養(yǎng)基（1/2MS、1/4MS）配合生長素IBA和NAA則能生根，最高的可達(dá)73.3%。

本研究以三倍體枇杷莖尖為材料，首次成功再生出完整植株，建立了三倍體枇杷莖尖植株再生的基本技術(shù)體系，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對三倍體枇杷進(jìn)行遺傳改良奠定了一定的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 邱武陵， 張恢志. 中國果樹志[M]. 北京： 中國林業(yè)出版社， 1996.

[2] 林順權(quán)， 楊向暉， 劉成明， 等. 中國枇杷屬植物的自然地理分布[J]. 園藝學(xué)報， 2004， 31（5）： 569-573.

[3] Yang Q， Fu Y， Wang Y Q， et al. Effects of simulated rain on pollen-stigma adhesion and fertilisation in loquat（Eriobotrya japonica Lindl.）[J]. Journal of Horticultural Science & Biotechnology， 2011， 86（3）： 221-224.

[4] Liang G L， Wang W X， Xiang S Q， et al. Genomic in situ hybridization（GISH）of natural triploid loquat[J]. Acta Horticulturae， 2007（750）： 97-99.

[5] 王永清， 李俊強(qiáng)， 鄧群仙， 等. 一種制備植物三倍體植株的方法[P]. 中國， 國家知識產(chǎn)權(quán)局 發(fā)明專利， 專利號： CN20091030921.

[6] 汪衛(wèi)星. 天然與人工合成三倍體枇杷基因組變異及其DNA甲基化分析[D]. 重慶： 西南大學(xué)， 2008.

[7] McCabe D E， Swain W， Martinell B， et al. Stable transformation of soybean（Glycine max）by particle bombardment[J]. Biotechnology， 1988（6）： 923-926.

[8] Lowe K， Bowen B， Hoerster G， et al. Germline transformation of maize following manipulation of chimeric shoot meristems[J]. Biotechnology， 1995（13）： 677-682.

[9] Keller G， Spatola L， McCabe D E， et al. Transgenic cotton resistant to herbicide bialaphos[J]. Transgenic Research， 1997， 6（6）： 385-392.

[10] Molinier J， Thomas C， Brignou M， et al. Transient expression of ipt gene enhances regeneration and transformation rates of sun ower shoot apices（Helianthus annuus L.）[J]. Plant Cell Reports， 2002（21）： 251-256.

[11]楊永青， 陳光祿， 唐道一， 等. 枇杷莖尖培養(yǎng)與增殖的研究[J]. 園藝學(xué)報， 1983， 10（2）： 79-86.

[12] 楊鳳玲， 林順權(quán). 枇杷莖尖組織培養(yǎng)初代培養(yǎng)物的建立[J]. 中國南方果樹， 2005， 34（6）： 36-37.

[13] 金萬梅， 董 靜， 閏愛玲， 等. 葡萄器官離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 園藝學(xué)報， 2008， 35（1）： 27-32.

[14] 趙艷華， 吳雅琴， 程和禾， 等. 李離體莖尖的超低溫保存[J]. 園藝學(xué)報， 2008， 35（3）： 423-426.

[15] Siripatr P， Sarut T， Pissawan C， et al. Efficient shoot regeneration from direct apical meristem tissue to produce virus-free purple passion fruit plants[J]. Crop Protection， 2011， 30（11）： 1 425-1 429.

[16] 陳君幟， 李 青， 孫 釗， 等. 中國櫻桃半野生種對櫻的莖尖培養(yǎng)[J]. 園藝學(xué)報， 2003， 30（3）： 317-318.

[17] 鐘曉紅， 戴思慧， 馬定渭， 等. 核果類果樹莖尖培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 果樹學(xué)報， 2003， 20（5）： 388-392.

[18] 張志勤， 肖婭萍， 王喆之， 等. 馬哈利櫻桃莖尖培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2004， 40（1）： 70.

[19] 陳麗靜， 于春葉， 李浩戈， 等. 南果梨莖尖離體快繁技術(shù)研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報， 2001， 27（31）： 168-173.