山蔞單芽莖段培養與快繁技術研究

李新等

摘 要 以山蔞單芽莖段為外植體，對其進行組織培養和快速繁殖研究。結果表明：山蔞嫩莖最佳消毒方法為70%酒精消毒30 s，再用0.1%升汞溶液消毒9 min；適合腋芽萌發的啟動培養基為MS+0.5 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA；繼代增殖培養最適宜的培養基為MS+0.1 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA；試管苗在1/2MS+3 mg/L NAA+0.1-0.5 mg/L 6-BA生根較好；山蔞試管苗移栽成活率可以達到95%以上。

關鍵詞 山蔞；組織培養；快速繁殖；表面消毒

中圖分類號 TS971 文獻標識碼 A

Abstract Tissue culture and rapid propagation of Piper sarmentosum were conducted with single-node stems as the explants. The results showed that the best surface sterilization was achieved by immersing the explants in the solution of 70% alcohol for 30 seconds then in 0.1% HgCl2 solution for 9 minutes. The medium（MS+0.5 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA）was suitable for starting culture of P. sarmentosum. Successful shoot proliferation was obtained on MS supplemented with 0.1 mg/L NAA and 3 mg/L 6-BA. The optimal rooting medium was 1/2MS+3 mg/L NAA+0.1-0.5 mg/L 6-BA.

Key words Piper Sarmentosum； Tissue culture； Rapid propagation； Surface sterilization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.026

山蔞（P. sarmentosum Roxb.）別名有山撈、假蒟、假蔞等，為胡椒科胡椒屬植物。在中國海南、廣東、廣西、云南、福建等南部省區均有分布。山蔞葉面光亮有革質，有一種特異的香味。在海南黎族地區，人們常常用它的葉子來做菜，極具地方風味特色，著名的菜品有“黎家綠葉寶”、“山蔞葉肉碎煎蛋角”、“山蔞葉煎蛋”、“假蔞煎肉夾”、“魚茶釀苦瓜”等，另外，山蔞葉還可用來爆炒、紅燒、干煸、煲煮各色肉品，使菜肴口味醇厚濃香，深受食客歡迎[1-4]。據測定，山蔞葉的維生素、蛋白質、氨基酸和礦質元素營養含量豐富，尤其是山婁葉中鈣、鐵、鋅、錳和鍶的含量很高，屬于超鈣富鉀、富鋅超鐵蔬菜，除具有獨特的風味外，還具有良好的保健功能[5]。此外，山蔞具有一定的藥用價值，可以全株、根、葉或果實入藥。藥性辛，溫。溫中散寒，祛風利濕，消腫止痛。用于胃腸寒痛、風寒咳嗽、水腫、瘧疾、牙痛、腳氣、痔瘡、風濕性關節炎、疝氣痛、風濕骨痛、跌打損傷[2]。因此，不論是作為熱帶特色的香菜，還是作為藥用植物，其開發前景都十分廣闊。

山蔞繁殖可以用扦插、壓條、種子進行繁殖[6]，但常規繁殖方法使用的繁殖材料多，繁殖速度慢，不利于大規模推廣種植。而采用組織培養方法進行繁殖，使用起始繁殖材料少，繁殖速度快，而且可以在一定的空間內實現工廠化生產，能在短期內滿足大規模推廣種植需要[7-8]。目前，對山蔞的組織培養研究尚未見有關報道。因此，本文利用山蔞單芽莖段通過叢生芽途徑進行快繁，旨為山蔞的擴大種植和開發利用奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

材料取自海南大學（儋州校區）農學院苗圃基地以及海南大學（儋州校區）園藝園林學院實驗基地。2012年7月取野外生長的山蔞進行室內盆栽，待嫩莖長出后取材；另于2013年3～7月連續晴天數天時，上午取材，選取生長旺盛、無病蟲害的嫩莖。

1.2 方法

1.2.1 外植體的表面消毒與接種 將采集的山蔞嫩莖剪成長為3 cm左右的單芽莖段，清水浸泡10～20 min，然后轉移到洗衣粉水中浸泡15 min，再用流水沖洗30 min后，放入含有多菌靈的溶液中浸泡30 min，再用流水沖洗1 h，用吸水紙慮干備消毒處理。消毒時先用70%酒精浸泡單芽莖段30 s，然后在轉移到0.1%升汞溶液（滴有2～3滴吐溫）中處理3～12 min。將消毒處理后的外植體用無菌水沖洗4～5次，用滅菌濾紙濾干后放在超凈工作臺上備用。接種時，在超凈工作臺上將單芽莖段修剪成1 cm左右，插入滅菌培養基。每個處理接種20瓶，每瓶接種1個外植體，重復3次，于接種15 d后統計污染率、褐化率以及存活率，選擇最佳消毒方式。污染率/%=污染的外植體個數/接種外植體總數×100；褐化率/%=未污染的褐變外植體個數/接種外植體總數×100；存活率/%=存活的外植體個數/接種外植體總數×100。

1.2.2 初代培養 初代培養使用的啟動培養基為MS+0～0.5 mg/L NAA（1-naphthaleneacetic acid）+0～4 mg/L 6-BA（6-benzylaminopurine）。每個處理組合接種20瓶，每瓶接種1個外植體，3次重復，30 d后統計萌芽率。萌芽率/%=產生芽的外植體數/總的接種外植體數×100。

1.2.3 繼代培養 將初代培養生長出來的腋芽接種于附加0～0.2 mg/L NAA、0～4 mg/L 6-BA的MS培養基上，每個處理接種20瓶，每瓶接種1個外植體，3次重復，20 d后統計增殖系數。增殖系數=繼代增殖培養1個周期后產生的芽數/增殖培養前轉接的芽數。

1.2.4 生根培養 將長至適當高度的苗芽接種于附加0～3 mg/L NAA、0～0.5 mg/L 6-BA的1/2 MS培養基上，每個處理接種20瓶，每瓶接種1個外植體，3次重復，20 d后觀察生根狀況并統計生根率和平均生根長度。生根率/%=生根苗數/總的接種株數×100，平均根長（cm）=根總長/生根數。

1.2.5 培養條件 以上培養基均附加30 g/L蔗糖，6 g/L瓊脂粉，pH值滅菌前調至5.8；培養基在滅菌鍋里滅菌的溫度、時間分別為121 ℃、30 min；培養室內溫度控制在（25±1）℃，光照強度2 000～3 000 lx，光周期16 h/8 h（晝/夜）。

1.2.6 煉苗移栽 將生根發育良好的組培苗連同培養瓶移到室外遮陰棚中進行閉瓶煉苗10 d左右，然后將培養瓶的蓋子打開，在自然光下進行開瓶煉苗5 d左右。試管苗移栽時用鑷子小心取出，用無菌水沖洗根部附著的培養基成分，并用0.1%的高錳酸鉀溶液清洗，把生根苗移栽到黏土：河沙（1 ∶ 1）基質中，然后進行常規管理。

1.3 統計處理

實驗中所獲得的各處理數據均先用反正弦函數代換，再進行方差分析，在p<0.05水平上，用Duncan法做多重比較[9-10]。

2 結果與分析

2.1 外植體消毒

直接從野外采集外植體進行消毒，無論如何處理，污染率極高，幾乎得不到無菌材料。采用室內盆栽植株的外植體進行消毒處理的結果見表1。未進行消毒處理的對照組，接種材料全部污染，褐化率和成活率均為0。隨著消毒時間的增加，污染率由升汞消毒3 min的100%逐漸降低，到消毒12 min時只有8.3%；而褐化率在處理3～6 min時均為0，之后逐漸升高，消毒12 min時達到73.3%；而成活率也隨消毒時間的增加而提高，在處理8（升汞消毒9 min）達到最高，顯著高于其他處理，之后隨著消毒時間的增加，成活率呈下降趨勢。

2.2 初代培養

由表2可知，在相同NAA濃度的不同組處理中，萌芽率大體上隨6-BA濃度的增加而增加。處理14，即MS培養基添加0.5 mg/L NAA和3 mg/L 6-BA處理所得的萌芽率最高，達到78.3%，顯著高于其他處理。當6-BA濃度為0，NAA濃度為0.25 mg/L及0.5 mg/L時，處理所得萌芽率次低和最低，分別達11.7%和10%，顯著低于其他處理。

2.3 繼代培養

如同在初代培養中的情況，在相同NAA濃度的不同組處理中，繼代增殖率隨6-BA濃度的增加而增加。由表3可知，處理10（MS+0.1 mg/L NAA+4 mg/L 6-BA）的增殖系數為3.3，顯著高于除處理9（MS+0.1 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA）外的其它處理。在NAA濃度為0.1 mg/L或0.2 mg/L但不附加6-BA的情況下，可能由于生長素NAA對增殖的抑制作用，未見增殖芽產生；而6-BA濃度達到4 mg/L時，基部產生的愈傷組織較嚴重，產生的苗也較弱（結果未顯示）。綜合來看，處理9的增殖效果較好。

2.5 生根培養

由表4可知，山蔞苗芽生根率在各NAA和6-BA濃度組合中隨生長素NAA濃度的增加而增加，而且附加一定量的6-BA更有利于生根。處理15（1/2MS+3 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA）、14（1/2MS+3 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA）和處理16（1/2MS+3 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA）的生根率分別為95%、83.3%和81.7%。統計分析結果表明，這3個處理差異不顯著，但與其他處理的差異均達到顯著。處理14的根長最長，除了與處理10、處理15以及處理16之間的差異不顯著外，與其余各組處理之間的差異均顯著。但各處理的生根數都只有1～2條。

煉苗移栽結果表明，山蔞試管苗移栽成活率可以達到95%以上。

3 討論與結論

外植體的消毒處理是決定組織培養能否成功的關鍵因素之一。由于山蔞野生于高溫陰濕的橡膠林下，從野生環境中采集的外植體不可避免地攜帶大量的外生菌和內生菌，內部污染是極難進行表面消毒的。本試驗從野生環境中取材表面消毒幾乎無法成功，這與同屬的栽培胡椒組織培養中外植體的污染問題類似[11]。只有將野生植株移栽到潔凈環境采集新長出的外植體，才獲得成功。0.1%升汞溶液是一種強效滅菌劑，雖然隨著消毒時間的延長，污染率會降低，但在殺滅外植體菌種的同時，亦可能對外植體本身產生傷害，導致外植體接種后出現褐化現象，并在某個處理時間之后降低成活率。這也是本試驗中0.1%升汞消毒10 min以上處理反而使褐化率和成活率降低的原因。

利用山蔞單芽莖段進行啟動和增殖培養中，6-BA發揮極其重要的作用，在相同NAA濃度的不同組處理中，萌芽率和增殖率大體上隨6-BA濃度的增加而增加；在附加生長素NAA而不附加6-BA的情況下，增殖系數均為0。同時觀察到，6-BA與NAA組合要比單獨使用6-BA對啟動和增殖培養的效果好。這與同屬植物栽培胡椒的組織培養情況類似[12-13]。

由于胡椒屬植物難以表面消毒（尤其是內源性污染）和容易褐化，胡椒屬中不同物種的組織培養的難易程度具有物種和基因型的依賴性，因此，胡椒屬植物仍然是目前較難組織培養的植物之一。在胡椒屬植物莖尖和莖段培養方面，除劉進平等[12-13]對大葉種胡椒進行組織培養外，Mathew等[14]對胡椒的一個雜種Panniyr 1的無菌萌發實生苗莖尖進行了培養，在MS+1 mg/L IAA（3-indolylacetic acid）+1 mg/L 6-BA上實現叢生芽增殖；Philip等[15]對6年生的胡椒品種Panniyur-1、Karimunda和Arivalli大田苗的莖尖進行培養，在附加或不附加160 mg/L AdSO4的MS+1.5 mg/L 6-BA培養基上可增殖成芽。而Bhat等[16]在對胡椒屬的3個種胡椒（P. nigrum）、P. betel和P. longum的根、葉、節和節間外植體的形態發生潛力進行了比較，發現P. colubrinum的反應最好，其次為P. betel和胡椒（P. nigrum），并且發現6-BA對芽的誘導優于KT（kinetin）。本文對胡椒屬植物山蔞（P. sarmentosum）組織培養進行研究，利用室內萌芽抽條作外植體，有效克服了不能獲得無菌培養的困難，同時，6-BA與NAA組合可實現叢生芽增殖。

本試驗結果表明，山蔞幼嫩莖段最佳消毒方法為70%酒精消毒30 s后再用0.1%升汞溶液消毒9 min；啟動培養基以MS+0.5 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA為宜；繼代增殖培養最適宜的培養基為MS+ 0.1 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA；生根培養基采用1/2MS+3 mg/L NAA+0.1-0.5 mg/L 6-BA生根效果較好。利用本試驗結果可成功地對山蔞進行組織培養和快速繁殖，這將為山蔞大規模推廣種植打下種苗工廠化生產的技術基礎。

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