甘草多糖試用3， 5 二硝基水楊酸比色法測定其多糖含量的考察

范文彤

【中圖分類號】R629 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2017）10-0-01

理論與經驗豐富的糖類科學家們很早就試圖使用具有能夠明顯提高人類機體免疫應答的多糖類物質來預防和治療疾病。其中尤以成分中富含大量多糖成分植物與動物的研究日趨受到科學家們重視與青睞。現階段作為藥物或保健品已問市的多糖類產品有香菇多糖、黃芪多糖、銀耳孢糖、刺參多糖、納豆多糖和甘草多糖等。

目前多糖的含量測定方法主體上有色譜法和比色法。色譜法是利用凝膠色譜技術將多糖與單糖或低聚糖分離后，再根據是否有對照品分別采取相應的方法測定，特點是結果準確但費用較高；比色法，是通過簡單的水解反應后，經比色來進行測定的方法，其經常使用的方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和3 5-二硝基水楊酸比色法（DNS 法）。在90 年代，美國公職分析化學家協會（AOAC） 將苯酚-硫酸法列為標準方法，但苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法只能測定總糖含量而不能分別測出單糖與多糖的含量。而DNS法[1]與前兩種方法相對比，其最大的特點是，在堿性條件下顯色，故可以準確測定單糖與總糖的含量，通過二者的差可以很快的計算出多糖的含量。本文選定使用3 5-二硝基水楊酸比色法測定了甘草多糖中多糖的含量并對其做了相應的方法學研究加以闡述及考察。

1 儀器與試劑

島津公司UV-2450 型紫外-可見分光光度計，葡萄糖對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，甘草多糖，甘草多糖對照品（按干燥品計算多糖含量為97.68%） 均由中新藥業集團股份有限公司中新制藥廠試制并提供。

2 測定方法

對照品溶液的制備 取在105℃干燥至恒重的葡萄糖對照品約50mg，精密稱定，置200ml量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻。

測定單糖用溶液的制備 取供試品約400mg，精密稱定，置60ml小燒杯中，加純化水30ml，40℃磁力攪拌30min，再在50℃超聲中超聲45min，冷卻至室溫，移至100ml量瓶中，加純化水稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄初濾液，收集續濾液，即得。

測定總糖用溶液的制備 取本品約100mg，精密稱定，至250ml三角瓶中，加水100ml ，加入3mol/L硫酸（18→100）25ml，搖勻，在水浴中水解1.5小時，冷卻至室溫，加3至4滴酚酞指示劑，加10mol/L氫氧化鈉溶液20ml，用10%氫氧化鈉溶液回滴至中性（淡粉紅色），加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄初濾液，收集續濾液，即得。

測定法 精密量取上述對照品和供試溶液各2ml，置于大試管中，再精密量取DNS顯色液1.5ml，加入混勻，置水浴中水浴15分鐘后，取出，用冷水冷卻至室溫，移至25ml量瓶中，加純化水稀釋至刻度，搖勻。照分光光度法 （中國藥典2015年版），在520nm波長處測定吸收度，同法測定空白，計算，即得。

多糖含量（%）=總糖含量（%）-單糖含量（%）

編號 含量（%）

1 68.77

2 67.63

3 66.87

甘草多糖純品 97.68

3 方法研究

3.1 供試品溶液的穩定性考察

取顯色后的供試品溶液分別放置于0、2、4、 6 、8 小時后，測定，測定結果見表1，結果表明：所測定的樣品性質穩定，結果無明顯差異，采用的供試品溶液的穩定性不隨時間的改變而改變。

3.2 甘草多糖酸水解后產生還原糖的種類鑒定

甘草多糖酸水解后產生還原糖的種類鑒定：利用糖分析專用柱的HPLC法予以鑒定。

3.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

糖分析專用柱（4.6×250），乙腈-水（75：25）為流動相，示差折光檢測器，柱溫30℃，流速1ml/min。

在上述條件下，葡萄糖、果糖、蔗糖的分離度應符合規定，按葡萄糖峰計算，理論板數應不低于2500。

3.2.2 方法的檢出限度

按5倍于基線噪音計算，果糖、葡萄糖、蔗糖的檢出量為0.05μg。

3.2.3 測定結果

將含量測定項下水解后的供試品溶液用2mol/L氫氧化鈉溶液調至中性后，以每分鐘5000轉離心30分鐘，取上清液20μl注入液相色譜儀。結果出現單一峰，其保留時間與葡萄糖對照品峰一致經加入法驗證峰形未發生變化，故初步鑒定：甘草多糖酸水解生成葡萄糖，故在含量測定中用葡萄糖作為對照。

3.3 測定波長的選擇

取顯色后的對照品和供試品溶液在400～700nm 波長范圍內掃描結果；表明顯色后的最大吸收波長均在482nm， 若在該波長下測定空白溶液的吸收值大約為0.4 該實驗結果與報道的實驗結果一致[2-3]。然文獻報道多用520nm 或550nm 波長測定，經實驗結果表明以520nm 波長測定，無論新配試劑或是貯存試劑空白吸收值低（約0.04），且穩定故測定波長選用520nm。

3.4 線性關系考察

取在105℃ 干燥至恒重的葡萄糖對照品約50mg ，精密稱定，置100ml 量瓶中加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取2、 3、 4 、5 、6、 7 、8ml 置10ml 量瓶中加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取2ml ，自“精密加入DNS 顯色液1.5ml” 起，依法操作。結果表明：參加反應的葡萄糖在100 ～420ug范圍內，線性關系良好，相關系數為r=0.9999 （見表2 和圖1 ）回歸方程為y=-0.098+0.0018x

3.5 重現性考察

對同一批樣品，分別取樣6次，依法測定，結果見表3 ，結果表明本方法的重現性良好。

3.6 回收率考察

由于本測定方法是先將甘草多糖酸水解使之生成單糖，然后經證實其為葡萄糖后，再以葡萄糖為對照品進行測定，1 個分子的甘草多糖可以水解生成多少個分子的單糖目前尚不清楚。故在上述前提下，會通常使用回收率來考察，籍此來考察此方法是否適用于甘草多糖回收率的考察。使用本方法考察回收率，簡單，有效，具體考察方法如下：精密稱取甘草多糖對照品0.05g， 依本法測定并計算得多糖含量；再另精密稱取甘草多糖對照品0.05g， 加到研細的制劑供試品0.10g （相當于正常含量測定取量的1/2 并已知標識含量）中，依法考察，由測得的多糖總量減去本底含量為測得的加入甘草多糖量，按下述公式計算回收率回，收率：100.8% ，RSD： 1.4% （n=6）

回收率% = [ 總糖含量-標識含量/ 加入多糖對照品量]×100%

4 樣品的測定結果

按照含量測定方法分別對3批甘草多糖做了測定結果見表4。

5 結束語[4]

當前依據我國現行的質量標準，對含有多糖的藥物或保健品的含量測定主要仍是以總糖指標加以控制為主，如銀耳孢糖膠囊、納豆膠囊、甘草膠囊等，本方法實際上是探求及考察將總糖指標控制變為多糖指標，實際可行性，并對日后保證和監控多糖類藥品或保健品的質量具有實際的指導與應用價值。

參考文獻

韓玉蓮：植物中多糖的測定《中國食品衛生雜志》1995，7 （3），47-51

董文慧：云芝肝泰中云芝多糖的工業分析方法《中成藥》1990，12（2），33-34

董文慧：分光光度法測定云芝肝泰中云芝多糖的含量《中國藥科大學學報》1989， 20（3），175-178

張莉、李海生：3.5二硝基水楊酸比色法測定甘草多糖腸溶片中多糖的含量《天津市色譜學術交流會》 ， 2004endprint