外源NGF促進大鼠皮膚創面模型損傷修復的機制研究

（溫州醫科大學藥學院分子藥理研究中心 溫州 325035）

摘 要 目的：探究外源NGF對大鼠創面的治療作用及機制。方法：在SD雄性大鼠的背部脊柱的兩側手術切開形成兩個2 cm x 2 cm的傷口，右邊傷口處給予20 mg/ml NGF 1 ml，左邊傷口給等量生理鹽水作為對照組。隔天給藥到第14天（第14天停止給藥），分別于d3、d7、d14統計創面傷口愈合率，并取這3個時間點的組織用免疫組化的方法檢測轉化生長因子 （ transforming growth factor-β1，TGF-β1）、CD68-陽性巨噬細胞、增殖性細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF-1）的表達量。結果：NGF組的創面愈合率明顯高于生理鹽水組，并且NGF組TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表達量也顯著高于生理鹽水組（P<0.05）。結論：外源NGF具有促進創面愈合作用，其機制可能與趨化炎癥因子、加快血管生成、促進PCNA、TGF-β1的表達相關。

關鍵詞 神經生長因子 創面修復 炎癥趨化因子 血管生成 細胞增殖

中圖分類號：R628 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2014）17-0051-04

Study on the mechanism of exogenous nerve growth factor

in accelerating the wound healing in the model of rats with skin damage

LI Zhengmao， LV Chen， YANG Xuanxin， ZHANG Hongyu*

（The Institute of Molecular Pharmacology， Wenzhou Medical University， Wenzhou 325035， China）

ABSTRACT Objective： To study the therapeutic effect of nerve growth factor （NGF） on wound healing in rats and its mechanism. Methods： Two full thickness wounds （2 cm x 2 cm） extending through the panniculus carnosus were made on both sides of the back spine in SD male rats. The right incision （designated as an experimental group） was treated with 1 ml of NGF （20 mg/ml， dissolved in 0.9% sterile saline） every other day till 14th days while the left incision （designated as a control group） with equal amounts of 0.9% sterile saline. The rates of wound healing were recorded at day 3， 7 and 14 and the expression of transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， CD68+ macrophages， proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and vascular endothelial growth factor （VEGF-1） in wound tissues sampled at day 3，7 and 14 were detected by immunohistochemistry staining. Results： The rates of wound healing and the protein expression of TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1 were obviously higher in the experimental group than in the control group （P<0.05）. Conclusion： The mechanism of NGF in the promotion of wound healing might be related to the chemotactic factor， the promotion of angiogenesis and the expression of PCNA and TGF-β1.

KEY WORDS nerve growth factor； wounds healing； chemotactic factors； vasculogenesis； cell proliferation

神經生長因子（NGF）最早于1953年被Levi-Montalcini發現，并因此獲得了1986年諾貝爾醫學生理學獎。目前多用的是鼠源性NGF，包含a、b、g 3個亞單位，活性區是b亞單位，由兩個118個氨基酸組成的單鏈通過非共價鍵結合而成的二聚體[1] 。研究發現NGF具有：①促進神經元分化再生[2] ；②維持神經元的存活、生長、發育，尤其是對多巴胺能神經元的保護作用；③促進神經元的修復[3] ；④促進創口的表皮細胞、真皮細胞的生長，使其修復愈合[4] 。

皮膚創傷是一個復雜的病理過程，包括炎癥反應、細胞增殖、創面收縮、膠原代謝、新生血管形成及增殖、感覺末梢神經的恢復等基本過程，臨床表現為局部炎癥反應、細胞增殖分化及肉芽組織形成、組織重建三個階段[5] 。大量研究證實：創面愈合的各階段均有NGF參與并發揮重要作用。本研究將通過構建大鼠皮膚創傷實驗模型，給予外源NGF治療，在不同的時間點統計傷口愈合率，通過免疫組化染色對TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表達量進行檢測分析，探討NGF促進皮膚創傷修復的相關機制。

材料與方法

材料

SPF級成年雄性SD大鼠30只，體重200～250 g，購自上海斯萊克實驗動物中心（醫動字第04-20-3號）。UltraSensitiveTM S-P 超敏試劑盒（福州邁新，產品編號：KIT-9710）。外源性NGF由廈門北大之路生物科技有限公司提供。

方法

動物模型的建立

用8%的水合氯醛對實驗大鼠經腹腔注射進行麻醉，麻醉后固定于簡易操作臺，剪去背部毛發，用碘伏對背部皮膚進行消毒。用剪刀在其背部以脊柱為對稱軸的兩側剪兩個2 cm x 2 cm的傷口。右側傷口給20 mg/ml NGF 1 ml，左側給予等量的無菌生理鹽水（0.9%氯化鈉溶液）。隔天給藥到第14天（第14天不給藥）。

創面愈合率的統計

分別于d1、d3、d7和d14量取傷口未愈合面積（用透明的紙畫下傷口面積，再將畫下的面積復印到坐標紙上，數格計算出面積），計算比較傷口愈合率。傷口愈合率（%）=（開始時傷口面積-取材日傷口面積）/開始時傷口面積×100%[6] 。

皮膚組織處理

1）于d3、d7各處死5只大鼠，d14處理全部大鼠，取其背上創面的全層皮膚，進行石蠟包埋處理，切片厚度為7 mm。

2）通過免疫組化將已經包埋好的組織切片進行染色檢測，依次經過二甲苯及不同濃度梯度的酒精進行脫蠟后，在清水中沖洗一段時間，加入3% H2O2浸泡10 min，除去內源性的過氧化氫酶后再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中加熱3 min（溫度：95 ℃左右），使抗原的位點暴露出來，冷卻至室溫后進行血清封閉。再依次進行加一抗、二抗、SABC和由DAB/H2O2/磷酸緩沖液配置的染色液處理。隨后加入蘇木精中復染，脫水后進行封片，檢測TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表達量，根據檢測結果進一步對NGF是否有促進創面愈合作用作出判定[7-10] 。

結果

創面愈合率

NGF組與生理鹽水組在d1、d3、d7、d14的皮膚愈合率見表1，其差異具有統計學意義（P<0.05），表明外源NGF能夠加速創面的愈合。

TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表達量

TGF-β1是一族多肽類生長因子，可以作用于成纖維細胞，促進細胞增殖分化，抑制細胞凋亡，合成膠原蛋白，并調節創傷中各細胞間的相互作用，加速創面的愈合[7]。TGF-β1抗原表達多少與細胞增殖成正相關，可以反映出細胞的增殖狀態。由此推斷NGF能促進細胞增殖，從而促進傷口愈合（圖1）。

CD68是主要的單核-巨噬細胞抗原，其表達可以反應出巨噬細胞的分布，推測NGF可以誘導炎癥細胞在創面的聚集（圖1）。

PCNA陽性表達的強弱代表細胞增殖活動的高低，在細胞增殖的啟動上起著重要作用，是目前能較好反映細胞增殖狀況的指標[8]。表明NGF有利于傷口的愈合（圖1）。

VEGF-1作為一種血管生成調節因子，在創傷早期的大量表達有助于傷口的愈合[9-10]。推斷NGF可以促進VEGF-1表達，使創面處的血管細胞處于增殖狀態，從而加快傷口的愈合（圖1）。

討論

創傷愈合是一個涉及分子、細胞和組織水平的復雜生物學過程。在創面組織損傷修復過程中，細胞因子幾乎調控損傷后皮膚再生的全過程，包括細胞趨化、增殖、基質合成與降解、炎癥反應等多方面。TGF-β1作為一種大分子復合體作用于成纖維細胞，促進細胞外基質產生并抑制其降解，對細胞增殖、分化起重要調節作用[11]。CD68在傷口炎癥反應階段主要是趨化、聚集炎癥細胞，并清除壞死組織及細胞碎片[12] 。PCNA可促細胞增殖，并在細胞生長S期大量表達，故可將其作為評價細胞增殖狀態的重要指標[13] 。VEGF-1可直接作用血管內皮細胞，加強血管通透功能，促進血管內皮細胞增殖而形成新血管[14-15] 。以上4種蛋白的作用均在創傷愈合過程中有重大意義。

NGF作為一種神經生長因子，與堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）都是多功能的生物活性多肽，目前在臨床創面修復治療中，bFGF凍干粉已經成為一種重要的生物治療藥物。有文獻報道，在切斷成年大鼠的坐骨神經后，坐骨神經斷端吻合口處會立刻觀察到內源性NGF大量表達[5，16] ，表明NGF也會參與細胞的再生修復及傷口愈合的過程。由此推測NGF在創面愈合方面具有與bFGF相似的生物學效應[17]。為進一步探究NGF對皮膚創傷愈合的修復機制，本研究通過外源給予創傷模型NGF，并于不同的時間點對創面的愈合情況進行統計分析，發現NGF組的愈合情況要明顯好于生理鹽水組，但需要考慮到的一點是，大鼠皮膚與人體皮膚存在著差異，相對而言大鼠對皮膚創面具有更強的修復作用，因此在表1中，NGF組與生理鹽水組在d14都有較好的愈合效果。但總體而言，給予NGF后能夠顯著提高創面修復能力。本文實驗還分別對TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的表達量進行檢測，發現TGF-β1在d3、d7的表達量明顯高于生理鹽水組，愈合完全后（d14）表達量有所下降，原因可能是由于NGF組在d14已經達到幾乎完全愈合的效果，因此TGF-β1的表達量有所下降，而生理鹽水組在d14并未達到完全愈合效果，所以TGF-β1的表達量仍處于一個相對較高的水平。同樣地，NGF組的CD68、PCNA、VEGF-1的表達量在d3、d7也顯著高于生理鹽水組，并在d14相對低于生理鹽水組，這表明了NGF的給予會促進這4種蛋白的表達，從而達到加快傷口愈合的生物學效應。另外發現給予NGF后，PCNA在d3的表達要高于d7，推測其原因為大鼠皮膚出現創面時，其機體自身會即刻通過不同的細胞增殖來進行創面的修復，因而在d3其表達量較高。而NGF促進創面愈合的作用很有可能與促進膠原蛋白的沉積、血管的生成、加速傷口處的血液循環，使氧和營養物質能夠到達傷口部位，讓細胞得到充分的增殖，為傷口愈合提供有利的條件等有關，其具體機制仍有待于進一步的研究探明。

由此可見，NGF在創面修復中潛在的應用價值正在漸漸的凸顯出來。繼續探究NGF對創面愈合的修復機制，更好地利用NGF自身的生物學特點，將是今后研究的一個重點和方向，也將為臨床治療難愈創面提供新的策略。

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（收稿日期：2014-06-10）