左乙拉西坦逃避P—糖蛋白的藥理學(xué)機制研究

摘要：目的 初步探討左乙拉西坦逃避P-糖蛋白的藥理學(xué)機制。方法30例診斷明確的難治性部分性癲癇患者根據(jù)隨機、雙盲、安慰劑對照原則，隨機接受抗癲癇藥物左乙拉西坦添加治療或安慰劑治療。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法檢測基因型。結(jié)果 CC基因型受試者中，左乙拉西坦治療組9例，1例癲癇發(fā)作完全控制，3例顯效，2例有效，發(fā)作減少50%的有效率為6/9；安慰劑組7例中僅1例有效，發(fā)作減少50%的有效率為1/7。結(jié)論 左乙拉西坦添加治療CC基因型的難治部分性癲癇患者療效良好，可能與其逃避了P-糖蛋白的外排作用有關(guān)。

關(guān)鍵詞：左乙拉西坦； P-糖蛋白；藥理學(xué)；癲癇

目前認為，難治性癲癇的耐藥性主要與多藥耐藥基因1（multidrug resistance gene1， MDR1）中CC基因型及其所編碼的P-糖蛋白有關(guān)。左乙拉西坦是一種新型抗癲癇藥物，添加治療難治部分性癲癇發(fā)作有效且安全，其一藥理學(xué)機制可能是左乙拉西坦逃避MDR1中CC基因型編碼的 P-糖蛋白的外排作用，進入致癇灶而發(fā)揮抗癲癇作用。本研究就這一藥理學(xué)機制進行初步探討。

1 資料與方法

1.1一般資料 30例受試者均來自2006年3月～2007年11月天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科癲癇門診。

1.2納入標準 ①獲得受試者簽署的知情同意書；②男性或女性受試者，年齡18～65歲；③根據(jù)國際抗癲癇聯(lián)盟（International League Against Epilepsy，ILAE）分類標準確診為部分性癲癇無論有無繼發(fā)性全身發(fā)作者，病史為6個月以上；④回顧基線階段的8w內(nèi)應(yīng)出現(xiàn)至少8次部分性癲癇發(fā)作；⑤篩選訪視前，受試者持續(xù)、穩(wěn)定、規(guī)范服用至少3個月1～4種其他抗癲癇藥物。

1.3排除標準 ①正在妊娠或哺乳期的婦女；②有其他嚴重的器質(zhì)性疾病、精神病以及神經(jīng)系統(tǒng)進行性或變性疾病者；③基線期存在異常實驗室指標；④有酒精或其他藥物成癮史或濫用史者；⑤既往治療依從性不良者；⑥篩選訪視前3個月內(nèi)有癲癇持續(xù)狀態(tài)病史者。

1.4方法

1.4.1試驗藥品 左乙拉西坦和安慰劑均為外觀、形狀、顏色基本一致的片劑，采用相同包裝。試驗藥物左乙拉西坦片（250mg/片）、安慰劑（左乙拉西坦空白

模擬片）均由珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司中山分公司提供。

1.4.2試驗設(shè)計 30例受試者在進入臨床研究之前采取肘靜脈血2ml以備基因型檢測。采用隨機、雙盲、安慰劑對照添加治療研究方法，設(shè)置左乙拉西坦添加治療組和安慰劑組，樣本比例為2∶1，研究流程如圖1所示。①回顧性基線期：詳細詢問和判斷患者接受添加治療前8w內(nèi)（回顧性基線期）癲癇發(fā)作的類型及發(fā)作頻率，記錄神經(jīng)影像學(xué)、腦電圖及其他實驗室檢查結(jié)果，以及抗癲癇藥物的使用情況；②逐量加藥期：兩組受試者隨機接受試驗藥品左乙拉西坦或安慰劑，初始劑量為0.50g口服，2次/d亦即1.00g/d；2w后藥物劑量增加為1.00g口服，2次/d即2.00g/d；再2w后增至1.50g， 2次/d即3.00g/d。藥物加量期共為4w；③劑量維持期：達到上述劑量后穩(wěn)定服藥，維持治療l2w；④逐量減藥期：在此期間內(nèi)，藥物劑量逐漸遞減至1.00g，2次/d即2.00g/d；2w后減至0.50g，2次/d即1.00g/d，共治療20w。受試者在每次訪視時必須返還所有未服用藥物，根據(jù)核查剩余藥品數(shù)量評估患者的依從性。

1.4.3基因型檢測 ①外周血基因組DNA提取：樹脂型基因組TM DNA提取試劑盒（包括純化樹脂、GN結(jié)合液、漂洗液和離心純化柱）由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司提供。轉(zhuǎn)移0.50ml全血至1ml純化樹脂中，利用純化樹脂吸附DNA，以1.00ml GN結(jié)合液和0.50ml漂洗液漂洗純化樹脂；在離心純化柱中用0.80ml無水乙醇脫水，再以TE緩沖液洗脫純化樹脂，洗脫下來液體即為基因組DNA；②聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性檢測：反應(yīng)總體積為25μl，DNA模板約為100ng，DNA buffer 2.50 μl，Tag酶1.25U，dNTP3.80mmol（均由南京田埂公司提供）。引物各10pmol（南京金思特科技有限公司），其中上游引物為：5-ACTCTTGTTTTCAGCTGCTTG-3'；下游引物：5'-AGAGACTTACATTAGGCAGTGACTC-3'。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，58℃復(fù)性20s，72℃延伸30s，共進行33個循環(huán)，最后72℃再延長5min。10μl PCR產(chǎn)物與0.50μl的DpnⅡ限制性核酸內(nèi)切酶（紐英倫生物技術(shù)北京有限公司）37℃溫浴4h。取5μl酶切后產(chǎn)物，質(zhì)量濃度為2.50%瓊脂糖凝膠電泳，90V電壓，25min，溴乙啶染色，紫外燈下觀察。

1.4.4療效評價標準 根據(jù)患者16w治療期內(nèi)（逐量加藥期和劑量維持期）每周癲癇發(fā)作頻率與基線期對比降低的百分比，將療效評價指標共分為5級。①控制：發(fā)作率減少100%；②顯效：發(fā)作頻率減少≥75%～<100%；③有效：發(fā)作頻率減少≥50%～<75%；④無效：發(fā)作頻率減少≥-25%～<50%；⑤加重：發(fā)作頻率增加<-25%。減少50%的有效率為與基線對比每周癲癇發(fā)作頻率減少50%以上者比率。

1.5統(tǒng)計分析方法 所得數(shù)據(jù)通過SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，對不同基因型受試者人口學(xué)資料的分析采用兩獨立樣本比較的t檢驗；不同基因組受試者抗癲癇藥物療效的評價以百分比（%）表示，行Wilcoxon秩和檢驗。統(tǒng)計推斷的檢驗水準均為0.05。

2 結(jié)果

2.1人口統(tǒng)計學(xué)資料 本研究30例受試者中，因2例不能耐受嚴重不良反應(yīng)、1例治療無效退出，最終27例完成藥物觀察試驗。其中18例接受左乙拉西坦添加治療（治療組），9例服用安慰劑（安慰劑組）。基因型檢測結(jié)果：左乙拉西坦治療組CC基因型9例（男性5例、女性4例）；安慰劑組CC基因型7例（男性5例，女性2例）。表1所示兩組CC基因型受試者人口統(tǒng)計學(xué)資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），均衡可比。

2.2基因型檢測結(jié)果的判讀 所有受試者PCR擴增產(chǎn)物均為231bp，如圖2所示，經(jīng)DpnⅡ限制性核酸內(nèi)切酶酶切后共檢出兩個片段CC型等位基因，分別為163與68 bp；3個片斷CT型等位基因231、163和68bp；單個片斷TT型等位基因，為231bp。

2.3左乙拉西坦療效評價 如表2顯示，16w治療期內(nèi)，兩組CC基因型受試者療效比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=﹣2.013，P=0.042）。其中，左乙拉西坦治療組9例患者中1例癲癇發(fā)作完全控制，3例顯效，2例有效，發(fā)作減少50%的有效率為6/9；安慰劑組7例中僅1例有效，發(fā)作減少50%的有效率為1/7。提示，左乙拉西坦作為抗癲癇藥物的添加治療CC基因型的難治性部分性癲癇患者療效良好。

3 討論

P-糖蛋白是與ATP結(jié)合的超家族蛋白質(zhì)之一，編碼P-糖蛋白的MDR1基因位于第7號染色體26號外顯子的（C至T）3435，基因多態(tài)性為CC型（胞嘧啶-胞嘧啶）、CT型（胞嘧啶-胸腺嘧啶）和TT型（胸腺嘧啶-胸腺嘧啶）3種基因類型，其中CC型基因的增量調(diào)節(jié)可導(dǎo)致P-糖蛋白的過度表達[1]，從而造成癲癇患者對抗癲癇藥物的耐藥性。已經(jīng)研究顯示[2～3]，難治性癲癇患者血-腦屏障的毛細血管內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞表面均高度表達P-糖蛋白，它通過分解ATP而提供能量將抗癲癇藥物泵入血液，降低致癇灶內(nèi)的藥物濃度，故而影響了抗癲癇藥物對神經(jīng)細胞癇性放電的抑制作用。

傳統(tǒng)抗癲癇藥物多通過γ-氨基丁酸能（GABA）的異化作用、阻斷鈉離子通道以及阻斷低電壓激活的鈣離子內(nèi)流（T通道）等而發(fā)揮治療作用。而左乙拉西坦作用機制獨特：主要特異性地與突觸囊泡2A（SV2A）蛋白結(jié)合，抑制癲癇環(huán)路的異常放電，從而達到阻斷癲癇的發(fā)生。隨著左乙拉西坦在臨床的廣泛應(yīng)用，研究者發(fā)現(xiàn)左乙拉西坦能逃避P-糖蛋白透過血-腦屏障進入腦組織，若以微量泵將左乙拉西坦持續(xù)泵入慢性癲癇發(fā)作大鼠的腦組織中，發(fā)現(xiàn)左乙拉西坦能夠進入腦組織中的致癇灶。同樣發(fā)現(xiàn)，左乙拉西坦可使癲癇幼鼠海馬組織MDR1基因表達降低，對正常幼鼠海馬組織MDR1基因表達無明顯影響。

本研究從人類基因?qū)W角度初步探討左乙拉西坦逃避P-糖蛋白的藥理學(xué)機制。27例受試者中共檢出CC基因型者16例，也就是表達P-糖蛋白的受試者16例，其中接受左乙拉西坦添加治療者9例，安慰劑治療者7例。表達P-糖蛋白的受試者接受左乙拉西坦治療后癲癇發(fā)作減少50%的有效率為6/9；而安慰劑組發(fā)作減少50%的有效率僅為1/7。由此我們推測，左乙拉西坦可逃避CC基因編碼的P-糖蛋白的外排作用進入致癇灶。研究顯示苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平和丙戊酸鈉均具有誘導(dǎo)CC基因及其所編碼的P-糖蛋白過度表達作用，后者抑制抗癲癇藥物進入致癇灶的能力依次為苯妥英鈉>卡馬西平>拉莫三嗪>苯巴比妥>丙戊酸鈉、左乙拉西坦，并且呈劑量相關(guān)性。本研究中，CC基因型受試者所應(yīng)用的抗癲癇藥物主要包括苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平、丙戊酸鈉、拉莫三嗪以及托吡酯等，證實了上述觀點。

總之，左乙拉西坦作為一種新型的抗癲癇藥物，確切藥理學(xué)機制尚未闡明。本研究觀察的樣本數(shù)量較少，尚不能獲得明確的結(jié)論，下一步我們將擴大樣本數(shù)量，以期為左乙拉西坦治療難治性癲癇的藥理學(xué)機制研究提供新的臨床思路。

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編輯/哈濤